Способ получения 7-метоксицефалоспори-hob или их солей

Способ получения 7-метоксицефалоспори-hob или их солей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

<>799668 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 25. 12. 76 (21) 2433852/23-04 (23) Приоритет — (32) 26. 07 ° 76 (31) 88770/76 (33) Япония

Опубликовано 23,01.81.Бюллетень Но 3

Дата опубликования описания 2Ы1,81

<51)М. К .

С 07 т 501/36

С 12 P 35/ООФ

A 61 К 31/545

Государственный комитет

СССР по делам - изобретений и открытий (53) УДК547 86Ý. .1.07(088.8) Иностранцы

Хироси Гусима, Кейсуке Муракайи, Исао Такахаси, Хироси Ямагути, Тосно Сасаки, Киеси Сусаки, Суити Такамура, Тосияки Миеси, Такаси Осоно, Есихико Ока, Сунити Ватанабе . и Такеси Санто (Япония) (72) Авторы изобретени я

Иностранная фирма

"Яманути Фармасьютикал Ко, Лтд":

Япония (71) Заявитель (54, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-МЕТОКСИЦЕФАЛОСПОРИНОВ

ИЛИ ИХ СОЛЕЙ

oc,í, НООС-(CH,),CONH+f 51

О СООМ

НООС

СИ-(СИ,,СОНИ

СООМ где R и М имеют укаэанные значения, аэробио воздействуют мицелием микроорганизма рода Trigonopsis, продуцирующего окисляющий 0-аминокислоту энзим, или обработанным продуктом мицелия и выделяют целевой продукт в виде свободной кислоты или соли.

Примерами азотсодержащей пятиили шестичленной гетероциклической группы служат пиридильная группа, 5-метил (или 5-карбоксиметилтио)Изобретение относится к способу получения цефалоспоринов с метокснльной группой в 7-ом положении, в частности к способу получения цефалоспо-. ринов, имеющих метоксигруппу или

4-карбоксибутирамидную группу в 7-ом положении и гетероциклическую тиометильную группу в 3-ом положении, ферментацией.

Известен способ получения 3-замещенной 7-метокси-7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-цефем-4-карбоновой кислоты или ее солей культивированием .продуцирующего 7-метоксицефалоспори- 15 новый антибиотик микроорганизма в водной культуральной среде в аэробных условиях, введением в образующуюся 7-метокси-7-(5-амино-5-.карбоксивалерамидо)-3-(карбамоилоксиметил)- 20

-3-цефем-4-карбоновой кислоты вводят соответствующий заместитель в положение 3 и выделяют целевой продукт в виде свободной кислоты или соли. Эти соединения обладают физиологически 25 активными свойствами (1).

Цель изобретения — получение новых производных цефалоспорина, расширяющих арсенал средств воздействия на живой организм. 30

Поставленная цель достигается способом получения 7-метоксицефалоспоринов формулы где R — азотсодержащая пяти- или шестичленная гетероциклическая группа, М вЂ” атом водорода или катионный остаток, образующий соль, заключающимся в том, что на соединение формулы II

799668

-1,3,4-тиадиазол-2-ил и 1,3,4-тиадиазол-2-ил или 1-метилтетразол-5-ил.

Катионный остаток М для образования соли цефалоспорина означает неорганический или органический остаток. Примерами неорганического остатка служат щелочные металлы (натрий и калий), щелочноземельные металлы (кальций, магний и барий), тяжелые металлы (железо, медь и цинк) . Примерами органического остатка служат основания, образующие четвертичные соли, как соли аминов (триэтиламин, диэтаноламин, пиперидин и морфолин).

Штамм рода Trigonopsis выбирают из типовой культуры или выделяют из почвы. Для увеличения активности об- 15 разования вещества формулы Х можно применять мутанты, получаемые из указанных штаммов. В качестве микроорганизма, обладающего активностью энзимного окисления 0-аминокислоты, можно ;щ указать на Trigonopsis variabitis.

Для получения вещества I с помощью микроорганизма, имеющего энзимную активность по окислению О-аминокислоты, предпочтительно микроорганизм сначала культивировать, а полученный мицелий или обработанный мицелий подвергать взаимодействию с цефалоспориновым соединением формулы II. В качестве мето= да культивирования с получением мицелия обычно применяют аэробное куль- ЗО тивирование, еще лучше применять жидкое культивирование при перемешивании и прн аэрации. В этом процессе применяют обычную культуральную среду. Можно применять искусственную, полуис- 35 кусственную или природную культуральные среды. В качестве источника углерода в такой среде применяют глюкозу, сахарозу, манитол, глицерин, декстрин, крахмал и растительное масло, в качестве источника азота применяют мясной экстракт, пептон, глютеновую муку, муку из хлопковых семян, соевую муку, арахисовую муку, рыбную муку, кукурузную барду, сухие дрожжи, дрожжевой экстракт, сульфат аммония, нитрат аммония, мочевину и другие органические или неорганические азотсодержащие соединения.

При необходимости в культуральную среду добавляют металлические со-, 56 ли (сульфаты, нитраты, хлориды, карбонаты, фосфаты натрия, калия, магния, кальция, цинка и железа). Кроме того, при необходимости в культуральную среду добавляют метионин., 5$ цистеин, цистин, метилолеат, силиконовое масло, поверхностно-активное вещество в качестве промотора образования или противовспенивателя.

Хорошие результаты получают при рН культуральной среды около 4-10, луч ше 5-6.

В частности, если в культуральной среде содержится D-(или DL-)аминокислота, например 0-(или DL-)ме- 65 тионин, D-(или DL †)ýëàíèí, 0-(или

DL -) валин, то достигается высокая активность энзима, окисляющего 0-аминокислоту. Температура культивирования обычно составляет 18-37ОС, лучше около 30 С. Длительность культивирования меняется в зависимости от условий культивирования, в частности используемого аппарата для культивирования, состава культуральной среды, температуры культивирования, но предпочтительно заканчивать культивирование, когда активность окисляющего

D-аминокислоту энзима становится максимальной. Обычно для этого требуется

2-10 дней.

Полученный таким образом мицелий или обработанный мицелий применяют для окислительной реакции 0-аминокислоты в исходном веществе формулы II. Обработанный мнцелий означает мицелий, который превращен в форму для продуцирования вещества I путем увеличения активности окисляющего

Э-аминокислоту энзима применением его соответствующей обработки.

Например, активно окисляющий

9-аминокислоту энзим обычно существует в мицелии, и обработанный мицелий означает освобожденный от клеток экстракт, с помощью физической или химической обработки мицелия, собранный из продукта культивирования штамма, продуцирующего окисляющий О-аминокислоту энзим. Промывают и частично или полностью очищают окисляющий

Э-аминокислоту энзим, полученный из несодержащих клеток экстракта путем применения методов разделения и очистки энзимов, активированный мицелий, полученный комбинацией частично или полностью очищенного окисляющего

0"-аминокислоту энзима, соединяют с водонерастворимым полимером или неорганическим носителем физическим или химическим методом и получают твердый активатор окисляющего Э-аминокислоту энзима или мицелия, затем активатор или мицелий подвергают активирующей обработке.

Получение и циркуляция указанного растворимого энзима практически ограничены, но применение нерастворимого энзнма, например активированного мицелия, удобно для промышленного применения, поскольку его можно легко выделить и применять повторно.

Активирующую обработку мицелия проводят путем нанесения мицелию слабого повреждения в такой степени, чтобы его не разрушить. Примером такой активирующей обработки служат: метод, по которому мицелий замораживают до температуры ниже -10 С при рН около 3-4, затем размораживают, метод, по которому мицелий обрабатывают в ванне одним или несколькими органическими растворителями, например ацетоном, бутанолом, 2-фе799668 нилэтанолом, диэтиловым эфиром, толуолом; метод, по которому мицелий обрабатывают 0,1-10%-ным раствором по-. верхностно-активного вещества, например катионным поверхностно-активным веществом,,(цетилтриметиламмонием, цетилпиридинием, цетилдиметилбензиламмоний галоидом), анионным поверхностно-активным веществом 1додецилсульфатом, алкиларилсульфонатом щелочного металла, деэоксихолатом натрия) или неионным поверхностноактивным веществом (монолауратом сорбитана, тритоном Х-100 в .его водном растворе); метод, по которому мицелий обра- 1Я батывают разбавлЕнным водным раствором гидроокиси калия или гидроокиси натрия н метод, по которому мицелий суспендируют в растворе с большим осмоти- щ ческим давлением, например 2М растворе сахара, а затем раствор быстро разбавляют водой.

На такую активирующую обработку сильно влияют разные факторы (например, температура, длительность обра. ботки, величина рН, концентрация реагента и другие), следовательно, необходимо подбирать условия активации ..

Кроме того, когда действие ката- 30 лазы, обычно присутствующей в мицелии, не ингибируется, то окислительное декарбоксилирование в конечный продукт I становится неполным с образованием одновременно 7-(5-карбок- 35 си-5-оксовалерамидо) -7-метоксицефало« споринового производного, представленного общей формулой IIT

Для селективного получения вещества I желательно ингибировать актив- 45 ность каталазы. Примерами соответствующих ингибиторов каталыэы служат аскорбиновая кислота, З-амино-1,2,4-триазол, азид щелочного металла (лучше аэид натрия). Ингибитор можно добавлять в реакционную смесь во время превращения исходного вещества II в вещество I, или мицелий можно предварительно обработать ингибитором перед применением. Количество азида натрия для этой цели составляет 1100 мм.

Кроме того, каталазу в мнцелии можно дезактивировать термообработкой мицелия до использования его в стадии превращения. При обработке 4ф мицелия при 40-60 С (лучше при 50 С) в течение не менее 3 ч значительно снижается активность каталазы, но активность D -аминокислотной оксидазы сохраняется. Термообработку мицелия $5

7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновая кислота (A);

7"(5-амнно-5-карбоксивалерамкдо)— -3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновая кислота (В);

7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)—

-7-метокси-3-(5-метил-1,3,4 -тиадиаэол-2-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновая кислота (С) и

7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)—

-7-метокси-3-(1,3,4-тиадиаэол-2-ил)-тиометнл-3-цефем-4-карбоновая кислота (О).

Примеры 7-метоксицефалоспорнновых производных формулы (1), полученных осн, 5

НООС-СО-(СН,1,СОНН ц i Сн25Â

СООН можно осуществлять в водном растворе или в буферной суспенэии. Особенно эффективно применять одновременную термообработку и обработку активирующим реагентом. Например, проводя активирующую обработку мицелия при 50 С в течение 4 ч с применением такого растворителя, как толуол, одновременно удается ингибировать каталазу и активировать мицелий.

Реакцию энзимной смеси активированного мицелия и исходного вещества (2 ) обычно ведут при рН 6-8. Желательно проводить реакцию при 3040 С. Длительность реакции зависит, главным образом, оТ активности энэима, но обычно она составляет 1-5 ч.

Энэимная реакция проводится в аэробных условиях,. т.е. при аэрации воздухом или кислородом.

Выделение продукта формулы Х можно вести при соответствующих условиях из ферментированного бульона исходного вещества формулы II после удаления из него мицелия, т.е. образовавшееся вещество I можно легко выделить экстракцией растворителем или сорбцией ионообменной смолой. Например, реакционную продуктовую смесь подкисляют до рН < 2,5, затем нужное вещество экстрагируют иэ этой смеси соответствующим органическим растворителем (этилацетатом, бутилацетатом, бутанолом).

В этом случае лучшие результаты дает комбинация ионообменной смолы и экстракции растворителем. Соответствующюаи ионообменными смолами являются жидкие аминовые аннонообменные смолы.

Целевой продукт можно также выделить с помощью твердой ионообменной смолы.

В этом случае хороший растворитель можно выбрать путем предварительного опыта.

Целевое вещество формулы I можно выделять не только в виде свободной кислоты, но и в виде его соли щелочного или щелочноземельного металла, соли органического амина.

Примеры исходных соединений формулы I:

799668 предлагаемым способом, и их свойства.

Пример 1. 7-(4-Карбоксибутирамидо)-3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновая кислота (}) осн

HAVOC-(СН) СОНН+-(И- Н

0 2 s 5СН сООн

CQ0H

Исходное соединение A формулы = ) }} 5 5- Ñ00Í> H} =H.

Физические и химические свойства.

Белый порошок, т.пл. 75-78 С. Легко растворим в метаноле и этаноле, растворим в воде, этилацетате, бутилацетате и бутаноле, плохо растворим в других органических растворителях.

Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию. Для УФ-спектра поглощения при определении в фосфорном буферном растворе 0,01 М и рН 6,5 максимум поглощения при .

278 ммк. ИК-спектр поглощения (при определении в виде таблетки KBr) при 3250, 2925, 1770, 1715, 1520 и 1380 см 1. ЯМР-спектр, определенный в ТЮ в качестве внутреннего стандар та в тяжелом метаноле, дает сигналы величина d (части/млн) 1,93 (2Н, мультиплет); 2,41 (4Н, мультиплет);

3,1 (ЗН, синглет); 3,37-3,81 (2Н, квартет, } 18 Гц); 4,11 (2Н, синглет); 4,15-4,63 (2Н, квартет, 3 14 Гц); 5,05 (1Н, синглет).

Элементный анализ для С„ Н И 0 5 .

2HZ0.

Вычислено,Ъ: С 35,99; Н 4,03;

H 9,33.

Найдено,%: С 35,77; Н 3,81;

М 9) !2.

Масс-спектр, определенный после гидролиза вещества 6 н.соляной кислотой в течение 2,5 ч при 100О С, экстракции продукта этиловым эфиром, сушки продукта испарением и силилирования бис-триметилсилилацетамидом (БСА), дает фрагмент при м/е 276

3 3=

Ь1 =- СНЪ)2

Конечное соединение представляет собой 7-метоксицефалоспориновое соединение, исходя из наличия, в частности, линий поглощения при

1770 см "(циклический лактам) в инфракрасном спектре поглощения и из сигнадов 3,5 (3Н, синглет, 7-ОСНОВ};

5,05 (1Н, синглет, 6-СН); 3,37-3,81 (2Н, квартет, J 18 Гц, 2-СН ); 4,154,6 (2Н, квартет, J 14 Гц, 3 — боковая цепь СН ) и 4,11 имп/мин (2Н, синглет, СН цепи -S-СН -СООН).Кроме того, имеются сигналы 1,93 (2Н, мультиплет, р-СН ) и 2,41 имп/мин (4Н, мультиплет, (, -CH ), показывающие наличие 4-карбоксибутирамидо в спектре ЯМР, и масс-спектр производного данного целевого соединения, которое гидролизуется соляной кислотой и силилируется, дает фрагмент м/е

276, поэтому конечное соединение (}) имеет указанную структуру, т.е.

5-амино-5-карбоксивалерамидогруппа в .7-ом положении исходного соединения подвергнута окислительному дезаминированию до 4-карбоксибутирамидогруппы.

15 Пример 2. 7-(4-Карбоксибутирамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновая кислота (ll)

ОСН Е иоос-(сн,,-сонн ) — 1 — "- СН -5 Il Г а

GOOH H

СН

Исходное соединение В формул

М вЂ” }4 где р,.} I ц:Н

СИ

Физические и химические свойства.

Белый порошок, т.пл. 80-83 С. Легко растворим в метаноле и этаноле, растворим в воде, этилацетате, бутилацетате и бутаноле, плохо растворим в других органических растворителях ;

3 натриевая соль легко растворима в воде. Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию. Для УФспектра в фосфатном буферном растворе 0,01 М с рН 6,5 максимум поглощения при 269 ммк. ИК-спектр определяют

4О в виде таблетки KBr при 3420, 2940, 1765, 1680, 1610, 1525 и 1390 см

RNP-спектр, определенный в TMS в качестве внутреннего стандарта в тяжелом метаноле, дает сигналы: величина

45 б (части/млн.) 1,94 (21, мультиплет);

2,40 (4Н, мультиплет); 3,51 (3H, синглет);3,40-3,83 (2Н, квартет, J 18 Гц);

3,99 (ЗН, синглет);4,17-4,50 (2H, квартет, 3 14 Гц); 5,02 (1H, синглет).

yg Элементный анализ для С Н N 075, гН10.

Вычислено,%: С 37,79; H 4, 76, К 16,53.

Найдено,Ъ: С 37,78, Н 4,75; и 16,41.

Масс-спектр, определенный после гидролиза вещества 6 н,соляной кислотой в течение 2,5 ч при 100 С, экстрагирования гидролизованного продукта этиловым эфиром, сушки испарением и фо силилирования BCA дает фрагмент при м/е 276 (СН )3 S i ООС СН СН СН СН COO

-5} (СН,), .

Конечное соедйнение представляЯ ет собой 7-метоксицефалоспориновое

799668

10 соединение, исходя, в частности, из наличия линии поглощения при 1765 см

1циклический лактам7 в инфракрасном спектре поглощения и из сигналов 3,51 (ЗН, синглет, 7-ОСНОВ);5,02 (1H, синглет, 6-СН); 3,99 (ЗН, синглет, 7-ОСНЗ );5,02 (1Н, синглет, 6-СН);

3,99 (ЗН, синглет, N-CH> тетразола);

3,40-3,83 (2Н, квартет, Х 18 Гц, 2-СН1) и 4,17-4,50 имп/мин (2Н, квартет, J 14 Гц, 3 †боковая цепь

СН1).Кроме того имеются сигналы 1,94 (2Н, мультиплет, р -СН ) и 2,40 имп/

/мин (4Н, мультиплет,, -СН 2), показывающие наличие 4-карбоксибутирамидо в спектре ЯМР, и масс-спектр производного данного целевого со- !5 единения, гидролизованного соляной кислотой и силилированного, дает фрагмент м/е 276, поэтому конечное соединение имеет указанную структуру, т.е. 5-амино-5-карбоксивалер- Щ амидогруппа в 7-ом положении исходного соединения подвергнута окислительному дезаминированию до 4-карбоксибутирамидогруппы.

Пример 3. 7-(4-Карбоксибутирамидо)-7-метокси-3-(5-метил-1

-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновая кислоты (!II) осн, НООС-(Сн,1,-СОЛОН -- — 4 — 3O — СН,.-,,-С„

О СООН Ъ

Исходное соединение С формулы ?.

И†N

= А .,н

СНз

Физические и химические свойства.

Белый порошок, т.пл. 95-99 С. Легко растворим в метаноле и этаноле, растворим в воде, этилацетате, бутилацетате и бутаноле, плохо растворим в других органических растворителях.

Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию. Для УФ-спект- 45 ра в фосфатном буферном растворе

0,01М при рН 6,5 максимум поглощения при 273 ммк. ИК-спектр определяют в виде таблеток KBr п и 3260,. 2925, .

1773, 1515 и 1375 см . ур

ЯМР-спектр, определенный в качестве внутреннего стандарта в тяжелом метаноле, дает сигналы: величина д (части/млн): 1,92 (2H, мультиплет); 2,40 (4Н, мультиплет); 2,71 (ЗН, синглет);3,38-3,80 (2Н, квартет, 3 18 Гц); 3,51 (ЗН, синглет), 4,17-4,64 (2Н, квартет, 0 14 Гц) и

5,03 имп/мин (1Н, синглет).

Элементный анализ для C„7H2îN401S .

Вычислено,Ъ: С 41,79, Н 4,1; .е0

N 11,47.

Найдено,%: С 41,89 Н 4,27;

N 11,17.

Масс-спектр, определенный после гидролиза вещества б н. соляной кис- 45 лотой при 100 С в течение 2,5 ч, экстрагирования продукта этиловым эфиром, сушки экстракта испарением и силилирования BCA дает фрагмент при м/е 276

СНЗ)>5 ООС СН2СН2СН2 СОО SI (СНЗ)3

Пример 4. 7-(4-Карбоксибутирамидо)-7-метокси-3-(1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновая кислота (IЧ)

ОСН

НООС -(СН,),-CONH 1 N — N Н СИ 5

0 GOOH

Исходное соединение 0 формулы 1„ и — N где g41, 1) Н = Н.

Физические и химические свойства.

Белый порошок, т.пл..88-92 C.

Легко растворим в метаноле и этаноле; растворим в воде, этилацетате, бутилацетате и бутаноле; ограниченно растворим в других органических растворителях. Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию.

УФ-спектр при определении в фосфатном буферном растворе 0,01 М при рН 6,5 дает максимум поглощения при

274 ммк.. HK-спектр определяют в виде таблетки KBr при 3250, 2925, 1770, 1515 и 1365 см

ЯМР-спектр, определенный в TNS в качестве внутреннего стандарта в тяжелом метаноле, дает сигналы: вели чина д (части/млн ) 1,92 (2H мультиплет); 2,40 (4Н, мультиплет); 3,39,3,83 (2Н, квартет, 3 18 Гц); 3,51 (ЗН, синглет ); 4, 24-4,73 (2Н, квартет

Э 14 Гц); 5,03 (1Н, синглет) и

9,35 имп/мин (1Н, синглет).

Элементный анализ для С Н< N O S °

О,5Н О.

Вычислено,В: С 3,74;. Н 3,96;

N 11,59.

Найдено,%: С 39,69; Н 3,87;

N 11,.32, Масс-спектр, определенный после гидролиза соединения 6 н.соляной кислотой в течение 2,5 ч при 100 С, экстрагирования продукта этиловым эфиром, сушки экстракта испарением и силилированием его SCA дает фрагмент при м/е 276 (СН ) 51-ООС-СН2СН2СНа СОО S i (СНЗ)3;

Конечное соединение представляет собой 7-метокснцефалоспориновое соединение исходя, в частности, из наличия линии поглощения при 1770 см (циклический лактам) в инфракрасном спектре поглощения и из сигналов 3,51 (ЗН, синглет, 7-OCH ); 5,03 (1Н, синглет, 6-СН); 9,35 (lH, синглет, СН тиадиазола); 3,39-3,83 (2Н, квартет, Х 18 Гц, 2-СН 2) и 4,24-4,73 имп/мин (2Н, квартет, T 14 Гц, 3 боковые

799668

Таблица 2

Соединение

Время удерживания

Исходное соединение А

3 мин 14 с

Сое

Целевое соединение I

13 мин 24 с

Исходное соединение В

1 мин 53 с

Исходное соединение A

Целевое соединение II

0,44 0,37 +

4 мин 54 с

Целевое соединение 1

Исходное соединение С

Целевое соединение IT I

Исходное соединение D

0,79 0 72

2 мин 55 с

Исходное соединение В

0,44 0,34 +

11 мин 18 с

1 мин 56 с

Целевое соедине ние II

0,81 0,64

Целевое соединение 1Ч

Исходное соединение С

5 мин 28 с

0,42 0,44 +

Целевое соединение III

Исходное соединение D

0,82 0 77

0,42 0,36 +

4S 7- (4-карбоксибутирамидо) -3-((3-и-оксифенил-2-метоксипропеноил)-оксиметил)-7-метокси-3-цефем-4-карбоновая кислота

5 мин 55 с

0,66 0,67 +

0,67 0,67 цепи СНа).. Кроме того, имеются сигналы 1,92 (2Н, мультиплет, -СН2); и 2,40 имп/мин (4Н, мультиплет, -СН ), показывающие наличие 4-карбоксибутирамидо в спектре ЯМР, и массспектр производного,.полученного путем гидролиэа конечного соединения соляной кислотой и силилирования продукта, дает фрагмент м/е 276, конечное соединение имеет указанную структуру, т.е. 5-амино-5-карбоксивалерамидогруппа в 7-ом положении исходного соединения подвергнута окислительному дезаминированию до 4-карбоксибутирамидогруппы.

В табл. 1 представлены результаты анализа соединений I iV и А-0 тонкослойной хроматографией. .Т а б л и ц а 1

Целевое соединение ЕЧ 0,81 0,65

7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3— f(3-и-оксифенил-2-метоксипропеноил )-оксиметил) -7-мето кс и-3-цефем-4-карбоновая кислота

7- (4-карбоксибутирамидо)-3- 1(3-и-оксифенил-2-метоксипропеноил )-оксиметил)-7-метокси-3-цефем-4-карбоновая кислота

П р и м е ч а н и е. Разделительные системы растворителей:

1-Изопропанол:бутанол:уксусная кис55

65 лота:вода (21:3:7:9 по объему). 2-Бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:2 по объему).

Определение проводят при помощи нингидриновой реакции, ультрафиоле- . тового поглощения 2536 А или биоавтографии (применяют Proteus вi—

rabi1is).

Все соединения дают положительный результат в двух последних пробах.

Результаты высокоскоростной жидкостной хроматографии приведены в табл. 2.

7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-.

-((3-и-оксифенил-2-метоксипропеноил)-оксиметил)-7-метокси-3-цефем-4-карбоновая кислота 5 мин 18 с

П р и м е ч а н и е. Система растворителей ацетонитрил: 0,1Ъ-ная уксусная кислота (1:9 по объему); рН 3,3. Для двух последних цефалоспориновых соединений отношение 2:8.

Действие соединений В, С, II u III в условиях in vivo определяют следующим образом.

В организм здоровых пяти мышей самцов вида ddy вводят путем внутрибрюшийной инъекции 10 клеток E.

coIi NlHY, и через два часа вводят

799668

10

20

Таблица 3

П ример 5. а) В эрленмейеровские колбы объемом 500 мл помещают по 100 мл культуральной среды, содержащей (рН 6,0)

20 r глюкозы, 4 г двузамещенного фосфорнокислого калия, 1 г сульфата магния, 0,5 r хлористого кальция, 0,1 г борной кислоты, 0,04 г молибдата аммония, 0,04 г сульфата марганца, 0,04 г сульфата цинка, 0,045 r сульфата меди, 0,025 r сульфата железа (11), 20 мкг биотина, 2 мг хлоргидрата тиамина, 1 г DL-метионина и

1000 мл воды. После стерилизации на каждую порцию среды производят посев штамма 1 FO 0755 Trigonopsis variabilis и проводят культивирование при

30 С в течение 72 ч.

По окончании культивирования получают около 1000 мл бульонной культуры, которую подвергают центрифугированию прн 4 С и 2000 об/мин в течение

30 мин, собирают мицелий и суспендируют его в 500 мл буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,1 М пирофосфата; к полученной суспензии мицелия прибавляют 5 мл Tritona Х-100 и, с целью активирования мицелия, в течение 20-40 мин взбалтывают смесь при

37 С, снова центрифугируют при 4 С е и 2000 об/мин в течение 30 мин,отделенный активированный дважды мицелий промывают буферным раствором пирофосфата с рН 7-8, снова суспендируют в 100-200 мл буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,1 М пирофосфата, получая суспензию активированного мицелия. б) В 10 мл 0,1 М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026% азида натрия, растворяют 54,5 мг 7- 15-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-f1-метил-1Н-тетразол-5-ил) тиометил-3-цепутем подкожной инъекции каждое соединение и определяют процент выживания после пяти дней. Аналогичные эксперименты осуществляют с вводом

10 клеток Proteus mirabilis 1287.

Каждая контрольная группа включает

10 мышей. Результаты представлены в табл. 3.

В 100 100 100 0 40 20 0 0

TT. 100 100 0 0 60 20 0 0

С 80 80 40 0 100 20 20 0

III 80 60 0 0 40 20 20 0

И

ЗЕ

И

65 фем-4-карбоновой кислоты и, после прибавления к этому .раствору 0,5 мл суспензии активированного мицелия, производят перемешивание его в условиях аэрирования на водяной бане с температурой 33 С. Каждые 30 мин реакционную систему проверяют с помощью аппарата Хитачи для скоростной жидкостной хроматографии. Система растворителей ацетонитрил:

0,1%-ная уксусная. кислота (объемное отношение 1:9) . Эту проверку осуществляют для определения окончания реакции, так как время задержки исходного соединения 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3†(1-метил-18-тетразол-5-ил) -тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты

1 мин 53 с, а время задержки конвертированной при этом эа счет окисления З-аминокислоты 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты 4 мин 54 с.

По окончании реакции мицелии уда.ляют центрифугированием, а всплываю щий слой отделяют путем доведения рН до 1,5-2,0 с помощью разбавленного водного раствора соляной кислоты и четырехкратного экстрагирования равными объемами этилацетата. Экстракт в этилацетате отделяют и снова экстрагнруют буферным раствором фосфата, имеющим рН 6,0. После этого буферный раствор доводят до рН 1,5-2,0 с помощью разбавленной соляной кислоты и снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Этилацетат ные вытяжки соединяют, сушат безводным сульфатом натрия H выпаривают досуха, после чего продукт хроматографируют на колонке с микрокристаллической целлюлозой Avicel (торговая марка) и смесью растворителей н-бутанолг уксусная кислота: вода (объемное отношение 4:1:2 ) при промывании колонки той же смесью раствори,телей.Каждую фракцию проверяют на антимикробную активность по отношению к Proteus mirabilis, отбирая фракции, обладающие этой антимикробной активностью, хроматографируют на тонкослойной пластине Avicel SF (торговая марка) и разделяют с помощью смеси растворителей изопропанол: н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3:

:7г9) и смеси н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение

4:1:2). После этого фракции, характеризуемые ультрафиолетовым поглощением в области света 2536 Й аппарата Манасулу (фирмы Манасулу Кагаку Когио К.К.) и Rg 0,81 и R g 0,64 соответственно, собирают, концентрируют и лиофилизуют, получая 35 мг чистой 7- (4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-515

799668

-ил) -тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты.

П р и и е р 6. В 10 мл 0,1 М пирофосфатного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026Ъ аэида натрия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо) -7-метокси-3-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты, прибавляют к раствору 0,5 мл суспензии активированного мицелия Тrigonopsis

variаЬi1is F0 0755, полученного так же, как и в примере 1,а. Смесь перемешивают при нагревании на водяной бане при 33 С и аэрировании, с целью окисления Э-аминокислоты. Окончание реакции определяют тем же методом скоростной жидкостной хроматографии, как и в примере 1б. Время задержки исходного соединения 7-(5-амино-5-карбоксива-. лерамидо)-7-метокси-3-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил) тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты 2 мин 55 с, а время задержки полученной окислением

D-àìèíîêèñëoTîé 7-(4-карбоксибутирамидо )-7-метокси-3-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты 11 мин 19 с.

По окончании реакции мицелий удаляют при 4 С а всплывающий слой отделяют, доводят до рН 1,5-2,0 с помощью разбавленного раствора соляной кислоты и зкстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Экстракты в этилацетате соединяют и экстрагируют буферным раствором фосфата, имеющим рН 6,0. Этот экстракт доводят до рН 2,5-2„0 и снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата, экстракты соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме. Используя колонку с микрокристаллической целлюлозой

Avicel (торговая марка) и смесь растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2), оста к продукта разделяют, применяя смесь растворителей того же состава.

Затем отбирают фракции, обладающие активностью по отношению к Proteus

mi rabi lis, хроматографируют их на тонкослойной пластине Avicel SF u проявляют соответственно смесью растворителей изопропанол : н-бутанол г уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3:7:9) и смесью н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2). Фракции, характеризуемые поглощением в ультрафиолете 2536 Й и 0,82 и Ry 0,77 соответственно, собирают, концентрируют, лиофилизуют и получают 32 мг чистой

7- (4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-3-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил) тио метил-3-цефем-4-карбоновой кислоты.

П р е р М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026% азида нат15

20 рия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты и, после прибавления к раствору 0,5 мл суспензии активированного мицелия, приготовленного таким же образом, как и в примере 1а, смесь перемешивают при аэрировании и нагревании на водяной бане при 33 С, чтобы осуществить окисление. Окончание реакции проверяют каждые 30 мин с помощью скоростной жидкостной хроматографин на аппарате Хитачи так же, как и в примере 1б. При этом время задержки исходного соединения 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо J-3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)— тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты 3 мин 14 с, а полученной в результате окислительного действия фермента -D-аминокислоты 7 4-карбоксибутирамидо) -3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты 13 мин 24 c.

По окончании реакции мицелий удаляют центрифугированием при 4ОС, а всплывающий слой отделяют, доводят до рН 1,5-2,0 разбавленной соляной кислотой и экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Экстракты в этилацетате собирают и снова экстрагируют буферным раствором фосфата с рН 6,0, экстракт доводят раз° бавленным раствором соляной кислоты в воде до рН 1,5-2,0 и повторно зкстрагируют четырежды равными объемами этилацетата, экстракты соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме.

Остаток разделяют, используя смесь растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение

4:1:2, на колонке с микрокристалличеСкой целлюлозой Ачiсе! и тем же составом растворителей. Проверяют антимикробное действие каждой фракции по отношению к Proteus mirabilis, и активные фракции хроматографируют на тонкослойной пластине Ач се(SF, проявляя разделение смесями растворителей изопропанол : н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное QTHoшение 21:3:7:9) и н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2) . Затем фракции, характеризуемые поглощением света в

И ультрафиолетовой области 2536 Л на приборе Манасулу и R 0,79 и 0,72 соответственно, собирают, концентрируют лиофилизуют и получают 30 мг чистой

7-(4-карбоксибутирамидо)-3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил-)тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты.

Пример 8. а). Культуральную среду, содержащую, Ъ: крахмала 1,0;

65 глюкозы 1,0, муки соевых бобов 1,5;

18

799668

17 экстракта дрожжей 0,5, кислого фосфата калия 0,1; сульфата магния 0,05 и хлористого натрия 0,3, помещают в

500 мл колбы Сикагичи, по 100 мл о в каждую, и стерилнзуют при 120 С в течение 20 мнн. В каждую порцию производят посев штамма У-G192 Streptomyces 0rganonensis а затем культивируют при 30ОС в течение 48 ч.

Другую культуральную среду помещают в двухлитровые колбы Сикагичи, по 400 мл в каждую, стерилизуют при

120 С в течение 20 мин и производят посев 2-3%-ной бульонной культуры.

Затем производят культивирование при

30 С в течение 24 ч и получают культуру для посева. 15

Отдельно в два 100-литровых ферментатора вместе с 10 мл Adecano! (торговая марка), помещают по 60 л культуральной среды, содержащей,%: крахмала 7; тонко размолотой клей- 20 ковины 2,0; муки соевых бобов 2,0; глицерина 0,8; кислоты Казамино 0,1; сульфата железа(ТТТ) 0,01 и 55 г гидроокиси натрия, 30 мин стерилизуют при 120 С и производят посев 800 мл, д полученной ранее культуры для посева.

Затем культивируют при 30 С в течение 24 ч. К полученному культуральному бульону прибавляют раствор 5-меркапто-1-метил-1Н-тетраэол,приготовлен-30 ный на водном растворе гидроокиси натрия и стерилизованный при высоком давлении так, что концентрация тетразола 0,05%. Культивирование ведут в течение 90 ч.

По окончании культивирования бульон доводят до рН 2,0 и к нему при перемешивании прибавляют Radiolite (торговая марка). Полученную смесь фильтруют на фильтр-прессе, фильтраты соединяют и получают 100 л смеси 40 фильтратов,содержащих 100 мкг/мл

7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты. 45

á) Фильтрат доводят до рН 3,0, пропускают через колонку с 12 л

Амберлнта XAD-2 (торговая марка}, колонку промывают 30 л воды и элюируют

30 л 50%-ного раствора ацетона в во- у0 де. Элюат концентрируют до объема

5,5 л, доводят его рН до 7,5 с помощью водного раствора гидроокиси натрия, удаляют нерастворимый осадок и прибавляют к раствору 320 мл суспензии активированного мицелня штамма Trigonopsis variabi)is I OF 0755.

Смесь 4 ч перемешивают при аэрированин, доводят до рН 1,5-2,0 с помощью водного раствора соляной кислоты и экстрагируют 4 раза равными объемами 40 этилацетата; экстракты соединяют, полученные 20 л экстракта в этилацетате снова экстрагируют 2 л буферного раствора фосфата, имеющего рН 6,0.

Этот экстракт в фосфатном раство- Я ре доводят водным раствором соляной кислоты до рН 1,5-2,0 н снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Этнлацетатные вытяжки соединяют и полученные в результате 8 л экстракта упарнвают в вакууме досуха, получая 15 r неочищенного продукта, который подвергают хроматографированию на колонке с порошком целлюлозы так же, как это производится в примере 5б и получают 6,1 г

7-(4-карбоксибутирамидо) -7-метокси-3— (1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тнометил-3

-цефем-4-карбоновой кислоты.

Пример 9. На культуральной среде, содержащей,r: глюкозы 5,0; пептона 1,0; кислого Фосфата калия

1,0; сульфата магния 0,5; экстракта солода 10,0; DL-метионина 1,0 и

1000 мл воды при рН 6,0 производят посев штамма Trigonopsis variabi!is

I FO 0755, затем культивируют по методике примера 5а и получают 1000 ип бульонной культуры, которую центрио

Фугируют при 2000 об/мин и 4 С, и получают мицелий. Мицелий суспендируют в 200 мл 0,1 М пирофосфатного буФера с рН 8,1. Полученную суспензию, помещают, по 50 мл в каждую,500 мл колбу Эрленмейера, прибавляют по 5 мл толуола и в течение 1 ч проводят культивирование при 37 С. После этого активированный мицелий отделяют на центрифуге при 2000 об/мин в течение 30 мин, промывают с помощью центрифуги 200 мл 0,1 M пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1.

Активированный мицелий снова суспендируют в 200 мл 0,1 M пнрофосфатного буфера с рН 8,1, а суспензию нагревают при перемешнвании на водяной бане при 50 С, чтобы инактивнровать каталазную активность. 5 мл полученной суспензии активированного мицелия прибавляют к раствору 100 мг

7- (5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты в 20 мл 0,1 М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1;5 ч перемешивают при 33 С при аэрировании, обрабатывают смесь, как указано в примере 5б, и получают 7-(4-карбоксибутирамидо) -7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновую кислоту.

Пример 10. Мицелий, полуvesHv!t Trigonopsis variabilis no методике примера 5а, замораживают при о температуре ниже -20 С больше 1 ч, а затем оставляют при комнатной тем.пературе до размерзания и суспендируют в 200 мл 0,1 M пирофосфатного раствора с рН 8,1; 5 мл этой суспензии прибавляют к раствору 100 мг

7-.(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3- (1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометнл-3-цефем-4-карбоновой кислоты в 20 мл.0,1 М пирофосфатного

799668

19

20 буферного раствора с рН 8, 1, содержащего 0,026% азида натрия. 5 ч пео ремешивают при аэрировании и 33 С и после обработки по методике примера 5б, получают 7-(4-карбоксибутирамидо) -7-метокси-3- (1-метил-1Н-тетразол-5-ил) тиометил-3-цефем,-4-карбоновую кислоту.

П р н м е р 11. К раствору 50 мг

7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо )-3— (3-п-оксифенил-2-метоксипропеноил)-оксиметил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты в 10 мл 0,1 M пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026% азида натрия, прибавляют 0,5 мл суспензии мицелия, полученного из Trigonopsis 15

variabilis по метод