Способ количественного определениябелка b биологической жидкости

Способ количественного определениябелка b биологической жидкости

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советсинк . Соцналнстическнк

Республнн

Тюменский государственный медицинский инсттГгут---.. (7!) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 6ЕЛКА

В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано при определении белка в крови, акстрактах тканей и органов, в белковых препаратах.

Известен способ определения белка в биологической жидкости путем обработки пробы анализируемой жидкости водным раствором смеси карбоната :натрия и ед кого натрия с последующей обработкой полученного раствора реактивом Фолина-Че1О околте н фотометрированием полученного окрашенного соединения $1).

Недостатком способа является его невысокая точность, сложность, связанная с тем, что некоторые восстановителн не)5 белковой природы способны восстанавливать фосфомолибдатвольфрамовую гетерополикислоту, увеличивая интенсивность окраски гетерополисини и искажая результаты определения белка .

Бель изобретения состоит в повышении точности способа и его упрощении.

Указанная цель достигается тем, что пробу анализируемой жидкости обрабатывают водным раствором смеси карбоната натрии и едкого натрия с последующей обработкой полученного раствора реактивом Фолнна-Чеоколте прн рН 9,8-10,2 и фотом етрированием полученного окрашенного соединения.

Отличительная особенность способа состоит в том, что обработку реактивом Фо. лина-Чеоколте ведут при рН 9,8»10,2.

Реактив Фолнна-Чеоколте является сложной смесью фосфомолибдатвольфрамовой, фосфомолибденовой и фосфовольфрамовой гетерополикислот, обладаквцих раэлия ным окислитепьно-восста ловите льным потенциалом, рН вЂ” оптимумом устойчивос ри g спек» трофометряческими характеристиками образующейся гетерополисини. Максимум поглощения фосфомолибдатвольфрамовой гетерополикиспоты 640-740 мм, кривая поглощения является результирующей кривых фосфомолибденовой и фосфовольфрамовой попикислот и их полисинью, оптимум устойчивости и максимальный окисли1 тельно-восстановительный потенциал находится в пределах рН 6,1-10,7.

В процессе восстановления гетерополикислоты происходит постепенная нейтрализация щелочных компонентов гидролизующей смеси кислыми компонентами реактива Фолина-Чеоколте. При этом в состав гидролизующей смеси входят ингра. диенты с различным рК- от рК 10""З (едкий натрий) и 10 {рК1 входящего в со» 1О став реактива карбоната натрия) до 10 (рК карбоната натрия) и, следовательно, в ходе реакции в зависимости от соотношения количеств щелочной гидролизирующей смеси и кислого реактива Фолииа-Че- 15 околте рН среды может стабилизироваться в широких пределах 13-7-10,2. Это, .в свою очередь, может обеспечить неадекватность процесса восстановления фосфомолибдатвольфрамовой гетерополикис- о лоты с преимущественным вовлечением в процесс восстановления фосфомолибденовой нли фосфовольфрамовой полнкислот с соответствующим изменением спектральных характеристик получаемых гетерополисиней 25 и, в конечном итоге, к искажению результатов определения количества восстановителя (белка). Следовательно, для того, чтобы обеспечитЫ восстановление только одной as поликислот, входящих в состав реактива. Фолина-Чеоколте, и стабильность спектральных характеристик, реакцию необходимо вести с таким расчетом, чтобы к концу проведения анализа кислотнощелочное состояние ее стабилизировалось

35 в,определенном пределе - это обеспечит постоянство вовлечения и реакцию одной. иэ .смеси поликислот и устойчивость образующейся гетерополисини.

Зто достигается еквимоляркой нейтра40 лизацией щелочных и кислотных компонен.тов гидролизующего реактива (смесь кирбоната натрия и едкого натрия (1), и раствора Фолнна-Чеоколте, диссоциацией в этих условиях иона HCO g- имеющего рК 10 н рН 10,2, 0,5 мл реактива

Фолина-Ч еоколте, разведенного до кислотности,в 2,24 раза превышающей щелочность реактива 1), полностью нейтра лизуют едкий натрий с рК 10, входящий в состав 2 мл реактива 1), и карбонат

"Т натрия с рН : 10, В этих условиях рН смеси стабилизируется в пределах 1010,5 за счет диссоциации иона НС03, что обеспечивает избирательность восстановления фосфомолибдатвольфрамовой ге4 терополикислоты, стабиль нос ть спектральных характеристик и оптической плотности образующейся гетерополисини, воэможность проведения реакции прн высокой температуре, ускоряющей процесс восстановления. В этих условиях достигается избирательность восстановления гетерополикислоты циклическими аминокислотами; цистпн цнстеин, в концентрациях 100 мг на 100 мл раствора белка, аскорбиновая кислота и сахароза, в концентрациях

500 мг на 100 мл белка заменяют процессу восстановления. В этих условиях

l 1 также исключается необходимость связывания белка в биуретановый комплекс, что позволяет исключить иэ анализа этот этап, а следовательно, упростить проведение реакции.

Пример 1.Реактив Фолина-Чеоколте:

100 г вольфрамовокнслого натрия и 25 г молибденовокислого натрия растворяют в

700 мл дистиллированной воды, добавляют 50 мл 85% фосфорной кислоты и

100 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь кипятят в круглодонной колбе,снабженнон,"; обратным холодильником, в течение 10 ч. Полученный реактив оттптровывают по фенолфталеину или под контролем рН метра реактивом 1. Рабочий раствор готовят путем разведения реактива 2 дистиллированной водой до кислотностн, в 2,24 раза превышающей щелочность реактива 1. . И сследуемый раствор белка (сыворотка, плазма, экстракты органов и тканей, растворы белковых препаратов - разведенные до содержания не более 10 мг белка на 1 мл раствора).

Пример 2..0 2 мл исследуемого раствора белка вносят в 2 мл реактива 1, пробы выдерживают 10 мин в кипящей водяной бине, охлаждают и вносят

0,5 мл рабочего раствора 2. дополнительно выдерживают в кипящей водяной бане

4Q с, охлаждают и фотометрируют при

640-740 н в кюветах 3 мм. Найденную оптическую плотность проб сопоставляI ют со стандартным графиком зависи мости оптической плотности от концентрации белка.

При проведении анализа данным методом окрашенный комплекс сохраняется в течение 48 ч, разрешающие способности метода 2 микрограмма белка в 0,2 мл раствора.

805146 Таблица 1

Мешающие влияния различных добавок при определении концентрации белка сравниваемыми методами

Вид

Кистени

100

100 кистин

Триптофан

100

500

Аскорбиновая кислота

Саха роза

Вода (контрольные показатели белка) 200 + 5,6 200 + 2,8

Х

- статистически достоверные отличия от контрольных показателей.

В целях стандартизации условий фотометрированим в обоих методах применены кюветы 3 мм, а для удобства расчетов единицы светопоглощения выражали в целых чис лах.

Результаты определения оптической плотности растворов белка в каждом из разведений цодвергапи статистической обработке, расчитывая среднеарифметический показатель (М), квадратическое отклонение единичного определения (0 ), срепнюю ошибку {Ич), и коэффициент вариации (V %). Полученные данные приводятся в. таблице 2.

Таблица 2

Ф

20 4 5 О 252 OJ101 5 6 6в7 0132 0 128 4 8

40 6,25 0,188 0,075 3,0 8,5 .0,544 0,217 6,4

Показатели оптической плотности проб при определении концентрации белка дан ным методом выше, чем при определении методом Лоури, что позволяет уменьшить ширину колориметрируемого слоя с 10 до зл

3 мм. Закон Лам берта-Вера сохраняется как в предлагаемом методе, так и в методе Лоури до концентрации белка. 1%.

Растворы с большей концентрацией необ ходимо перед определением разводить. Бы46 ли приготовлены растворы человеческого альбумина с содержанием 20, 40, 60, 80, 100, 200, 600 и 800 микрограмм белка в пробе. В каждом из разведений в 6 параллелях определяют содержание

45 белка данным методом и способом Лоури.

252+4,1 . 240+ 3,9

286 +4,3

120+ 6,0

210+4,4

200+ 3,8

202 1 2,7 1

222 + 2,4

201+ 4,2

200+ 3,6

805146Продолжение табл. 2

60 8,7 0,278 0,110 3,2 11,0 0,858

80 9,6 0 259 0,104 2,7 15,0 1,23

0,343

0,492

7,8

8,2

100 12,2 0,378 0,150 3,1 19,0 1,29 0,516 6,8.

200 20,0 0,520 . 0,208 2,6 30,5 2,32

О, 927 7,6

400 32е0 Оэ896 01860 2в8 42е0 3э36 1Э344 8е0

600 440 0104 0042 16 480 2 21

0,883 4,6

Оэ480 2в2 55эО 4э18 1э672 7е6

800 55,0 1,24

Средняя величина коаффициента вариации 2,97

6,86 ется в течение 40 с кипячения проб и сохраняется неизменным в течение 48 ч.

ЭО и более, что позвопяет фотометрировать, пробы в пюбой отрезок времени после образования цветного комплекса.

Способ количественного определения белка в биологической жидкости путем об-. работки пробы анапизируемой жидкости

4О водным раствором смеси карбоната натрия и едкого. натрия с последующей обработкой полученного раствора реактивом

Фопина-Чеоколте и фотометрированием полученного окрашенного соединения, о т л ы4S ч а ю шийся тем, что, с целью повыщения точности способа и его упрощения, обработку реактивом Фолина-Чеоколте ведут при рН 9,8-10,2.

5Q Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Пушкина Н. И. Биохимические методы исследования, Медгиз, 1963, с. 10 (прототип).

ВНИИПИ 3аказ 10868/63 Тираж 918 Подписное

Фытиап ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,,4

Для определения 60 проб данным методом понадобилось 54 мин, определение того же количества проб методом Лоури потребовало 196 мин времени.

Анализ попученных данных показывает, что интенсивность образования окрашенного комплекса существенно не бтличается в обоих сравниваемых методах, но ко аффициент вариации в предлагаемом методе в 2 раза меньше, чем в методе Лоури. Таким образом, положительная аффек-. тивность метода по сравнению с прототи пом (методом Лоури), закшочается в повышении воспроизводимости попучаемых результатов, сокращении более чем в 3 раза времени, необходимого для проведе ния. одного и того же количества авали эов, сокращении копичества операций в анализа и количестве нужных реактивов >

Кроме, того, в методе Лоури, нарастание интенсивности окраски проб продолжается в течение 6 ч и фотометрирование их в сроки, отличные от рекомендуемых мета .дикой (через 30-40 мин поспе смешения инградиентов) может привести к искажению результатов определения. В предла «; гаемом методе цветной комппекс образу

Формула изобретения