Способ получения препарата терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы из тимуса теленка

Патент 805631

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕЕПА- РАТА ТЕРМИНАЛЬНОЙ ДЕЗОКСИНУКЛЕОТИ-' ДИЛТРАНСФЕРАЗЫ ИЗ ТИМУСА ТЕЛЕНКА путем экстракции фермента' из измельченного сырья К-фосфатным буфером, отделения экстракта, хроматографирования его на,целлюлозном сорбентееС десорбцией'ферментаК-фосфатньм буфером рН 7,2±0,05 с последующим пропусканием полученного десорбируемого раствора через диэтиламиноэтилцеллюлозу^ о т л и -. чающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества препарата, в качестве целлюлозного сорбента используют a^.^инo- этилцеллюлозу с иммобилизованной; наней дезоксирибону клеи новой ^кислотой в количестве 45-70 мг/г сорбента.2. Способ по П.1, о т л-и ча ющ и и с я тем, что в качестве экстрг1гирукадего К-фосфатного буфера используют К-фосфатный буфер рН 7,4± .±0,057^»^

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) I

3(51) С 12 N 9/001 С 12 N 10

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, l

Д ° (21) 2743914/23-04 (22) 06.02.79 (46) 23.02,84. Вюл. )) 7 (53) 577.15.07(088.8) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР пю делАм изОБРетений и ОтнРытий

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (72) A.Ã. Акишев, В.В. Романов и В.К. Старостина (54)(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Щ ЕПАРАТА ТЕРМИНАЛЬНОЙ ДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДИЛТРАНСФЕРАЗЬ1 ИЗ ТИМУСА TEJIEHKA путем экстракции фермента из измельченного сырья К-фосфатным буфером, отделения экстракта, хроматографирования его на целлюлозном сорбенте.с десорбцией фермента

К-фосфатным буфером рН 7,2+0,05 с последующим пропусканием полученного десорбируемого раствора через диэтиламиноэтилцеллюлозу, о т л и -, ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества препарата, в качестве целлюлозного сорбента используют аминоэтилцеллюлозу с иммобилизованной: на" ней дезоксирибонуклеийовой кислотой в количестве 45-70 мг/г сорбента.

2. Способ по п.1, о т л--и ч а юшийся тем, что в качестве экстрагирующего К-фосфатного буфера используют К»фосфатный буфер рН 7,41

«+0,05.: ®

805631

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам получения препарата фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферази (ДНТФазы) из тимуса теленка и может быть использовано для анализа на содержание фермента ДНТФазы .в клеточных экстрактах животных тканей.

Получаемый препарат после его иммобилнзации может быть использован в процессах получения олиго- и полидезоксинуклеотидов.

Известен сп6соб получения препарата терминальной дезоксинуклеотидилтрансфераэы из тимуса теленка, состоящий из следующих стадий:

1.Экстракция фермента из предварительно изглельченного сырья К-Фосфатным буфером, рН которого обычно 7,4+0,05, отделение экстракта от остатков сырья.

2. Хроматографирование экстракта на фосфоцеллюлозе P-11 с десорбцией фермента К-фосфатным буфером рН

7,2+0,05;

3. Пропускание десорбируемого . раствора, содержащего фермент, че. рез диэтиламиноэтилцеллюлоэу для удаления нуклеиновых кислот;

4. Рехроматография раствора, полученного на предыдущей стадии, на фосфоцеллюлозе Р-11 (длительность

20-40 ч);

5. Концентрирование дезоксинуклеотидилтрансфераэы обработкой раствора (нн4) 80< в количестве 55%

2 ° т степени насыщения, перераствореие полученного осадка в К-фосфатом буфере рН 7,2. !

Расход Фосфоцеллюлозы на проведение 1 цикла выделения 6-8 r, 40 смола используется в 3-4 циклах.

Недостатками способа являются использование фосфоцеллюлозы Р-11 для сорбции ДНТФазы из гомогената тимуса. После 3-4 регенераций емкость фосфоцеллюлозы Р-11 падает в

2 раза, что делает ее непригодной для дальнейшего использования в процессе выделения ДНТФазы. Процесс регенерации Фосфоцеллюлозы длителен, он включает промывки Фосфоцеллюлоэы 0,15 н.НС1 в 50%-ном этаноле, во- дой, 0,15 н. ma08 с О,О05 Г4 ЭДТА и вновь водой. Регенерацию ведут в течеиие 2-5 сут в зависимости от

55 количества фосфоцеллюлозы.

Проведение рехроматографии

ДНТФазы на Фосфоцеллюлозе Р-11 яв.ляется длительным процессом вЂ” нанесение раствора ДНТФазы на колонку с Р-11 ведут в течение 20-40 ч.

Препарат, полученный данным способом, содержит помимо целевого

Фермента-. примесь фосфодиэстеразы (Фермента, разрушающего олиго- и полинуклеотиды) . i После иммобилизации 65 препарата, полученного на стадии

5, получают препараты иммобилизованной ДНТФазы, содержащие до

0,5 ед.акт/мг ФДЭ. Использование таких препаратов иммобилизованной

ДНТФазы в синтезе дезокснполимеров затруднено ввиду высокого содержания фосфодиэстеразы.

Цель изобретения вЂ” упрощение процесса получения препарата ДНТФазы,пригодного для использования в синтезе полидезоксинуклеотидов и улучшение качества препарата за счет снижения содержания фосфодиэстеразы в препарате.

Это достигается описываемым способом получения препарата ДНТФазы из тимуса теленка, который заключает"ся в экстракции фермента из измельченного сырья К.-фосфатным буфером (обычно имеющим рН 7,4+0,05), отде лении экстракта, хроматографировании его на целлюлоэном сорбентеаминоэтилцеллюлозе с иммобилизованной на ней дезоксирибонуклеиновой кислотой в количестве 45-70 мг/г сорбента с десорбцией фермента К-фосфатныгл буфером рН 7,2+0,05 с последующим пропусканием получаемого десорбируемого раствора через диэтиламиноэтилцеллюлозу.

Отличительным признаком данного изобретения является использование в качестве целлюлозного сорбента при хроматографии экстракта аминоэтилцеллюлозы с иммобилиэованной на ней дезоксирибонуклеиновой кислотой" в количестве 45-70 мг/г сорбента (ДНК-АЭ-целлюлозы), способ получения которой описан.

Таким образом, описываемый способ позволяет сократить длительность процесса за счет сокращения числа стадий до трех.

В результате проведения этих трех стадий выделения ДНТФазы получают препарат фермента с .удельной активностью но включению дезоксиденозиинтрифосфата 1000-1500 ед/мг, т.е, такой же, как после 5 стадий способа, - прототипа. Кроме того, этот препарат не содержит даже следов,фосфодиэстераэы вЂ” ферглента, разрушающего полинуклеотиды.

Выход ДНТФаэы составляет 14000вЂ”

18000 ед.акт. из.100 r тимуса.

Расход ДНК-А3-целлюлозы на проведение 1 цикла выделения ДНТФазы из 100 r тимуса составляет 12-20 г, сорбент может быть использован как минимум в 9 циклах. Как показали опыты по многократному использованию ДНК-АЭ-целлюлозы для выделения ДНТФазы из гомогената тимуса, хроматографические свойства ДНК-А3-целлюлозы не ухудшились в результате проведения 9 циклов выделения: выход и удельная активность препара805631 сухого веса) с содержанием ДНК.

50 мг/г сорбента и перемешивают смесь механической мешалкой в течение 1 ч, ДНТФазу объединяют и измеряют в них вешенную 0,2М К-фосфатом рН 7,2 с целью удаления нуклеиновых кислот из раствора ДНТФазы. Пропускают через колонку еще 4 мл 0,2М К-фосфатного буфера. рН 7,2, элюат собирают и объединяют с раствором фермента. °

В элюате измеряют оптическую плотность при 280 нм и 260 нм, активность ДНТФазы и фосфодиэстеразы. эстераза по-прежнему полностью отсутствует, удельная активность ДНТФазы позволяет. упростить процесс полу5 Тираж 522 Подписное,;, г.Ужгород,ул.Проектная, тов ДНТФазы в 1 и 9 опытах били одинаковыми, примеси фосфодизстеразы в йрепаратах отсутствовали полностью, Во всех случаях происходила не допуская вспенивания смеси. 3аколичественная сорбция ДНТФаэы и тем дают смоле отстояться в течение гомогената тимуса ДНК-АЭ- целлюлозой. 30 мин, верхний слой супернатанта, Это было установлено и контрольны- не содержащий частиц сорбента, деми опытами, в которых супернатанты кантируют и сливают в канализацию. после стадии 2 выделения ДНТФазы Сметанообразную суспензию смолы влина ДНК-AЭ- целлюлозе подвергали об- вают в колонку, нижний кран колонки работке фосфоцеллюлозой P-11. 10 открывают и дают. стечь жидкости до

Процесс регенерации ДНК-АЭ- целлю уровня смолы в колонке. Сорбент в колонке лозы также менее трудоемок, чем промывают 3-4 объемами 0,05М К-фосфата регенерация фосфоцеллюлозы Р-11. рН 7,2 до оптической плотности в элюате

Регенерация сорбента ДНК-АЭ-цел- при 260 нм 0,29 об.ед./мл,после чего люлозы заключается в обработке его 15 промывку прекращают.

1М 0,1М NaC1 путем перемешивания ДНТФазу элюируют с ДНК-ЭА-целлюмеханической мешалкой 1 ч. сорбента лозы 0,2 М К-фосфатом рН 7,2. Собис 5 ч. 1М+0,1М NaC1, которое повто- рают фракции по 6 мл и измеряют в ряют 3-4 раза, и водой. Процесс них активность ДНТФазы по включению регенерации длится 5-10 ч в зависи- gp йАМФ-С + в кислотонерастворимый промости от количества сорбента. дукт с олигонуклеотидами в качестве

Препарат ДНТФазы, полученный на инициатора. Фракции, содержащие

3-ей стадии очистки, иммобилизуют на сефарозе, активированной BrCN, оптическую ПЛОТНОСТЬ Д во Д 260 акТИВ

Препараты иммобилизованной ДНТФазы 25 ность ДНТФазы и фосфодиэстеразы. Выне содержат даже следов фосфодиэсте- ход по активности ДНТФазы составразы и пригодны для получения поли- ляет на этой стадии 15300 ед .акт.иэ дезоксинуклеотидов. 100 г тимуса (за 1 ед.акт. принимают.

При оценке активности за единицу ак- такое количество фермента, которое . тивности ДНТФазы принимали такое коли- катализирует включение 1 нм йАМФ в ,".чество фермента, которое включает в кис- кислотонерастворимую фракцию за 1"ч лотонерастворимый продукт 1 нмдезокси- при 37 С). Фосфодиэстераза во фрак-. аденозинтрифосфата (дйтФ) за 1 ч при 37 с. циях, содержащих Днтфазу, не обнаЗа единицу активности фосфоди- ружена при инкубации с субстратом в теэстераэы принимали такое количество чение 13 ч.В качестве субстрата испольфермента, которое гидролизует 1 нм З5 зовали и-нитрофениловый эфир тимидина., субстрата (паранитрофенилтимидилата) 45 мл элюата, содержащего ДНТФ- .за 1 ч при 37 С. о азу, пропускают через колонку с

Пример,(Bce операции проводят ДЭАЭ-целлюлозой объемом 9 мл уравноо

У при 2-5 С). 120 r тимуса, очищенного от пленок и жира, режут на ку- 40 сочки 5-10 см,, гомогенизируют их.в мясорубке. 100 r полученной измельченной массы помещают в стеклянный стакан, приливают 400 мл буфера, содержащего 0,04 2М ИаС1; 0,008 М КН,Р04» 45

0,03 4М К ЬРО рН 7,4,и перемешйва- ют смесь механической мешалкой в течение 1 ч, не допуская.-вспенива- После проведения этой стадии выход ния смеси. Смесь центрифугируют в ДНТФазы остается прежним, фосфоди течение 1 ч при 12000 об/мин в цент- 50. ! рифуге J-21 Beckman в роторе J-14.

Нерастворимый осадок отбрасывают, по включению аАТФ 1270 ед.акт./мг. супернатант помещают в стеклянный Использование описываемого спо стакан и доводят рН до 6,5, добав- соба получения препарата ДНТФавы . ляя 10%- ную СНЗСООН по каплям, при постоянном перемешивании механичес- чения препараТа дНТФазы за счет кой мешалкой, рН раствора измеряют сокращения числа стадий процесса; при помощи рН-метра. Смесь оставляют на повысить качество препарата эа ночь во льду, затем центрифугируют, не-:, счет удаления примесей фосфодиэс растворимый осадок отбрасывают. теразы на первой стадии; заменить

Супернатант, полученный при цент- 60 фосфоцеллюлозу Р-11 фирмы Whatman рифугировании (объем 400 мл) поме- более стабильным сорбентом, не трещают в стакан и вливают в него 90 мл бующим длительной регенерации растпастообразной ДНК-АЭ-целлюлозы (18 г ворами кислот и щелочей.

ВНИИПИ Заказ 1138/

Филиал ППП "Патент",