Способ получения иммобилизованныхферментных препаратов

Способ получения иммобилизованныхферментных препаратов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Iii) 8I07I8

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕ Н И Я

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Саветскик

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свил-ву— (22) Заявлено 18.08.77 (21) 2521481/23-04 (51 } М. Кл.з

С 07 G 7/02 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллетень ¹ 9 (45) Дата опубликования описания 07.03.81

Государственный комитет по делам изобретений н открытий (53) УДК 577.15.07 (088.8) (72) Авторы изобретен )я

М. М. Рахимов, М. Х. Таджиев, Х. Т. Хасанов и Ф. Ибрагимов (71) Заявите,п

Среднеазиатский научно-исследовательский проектно-конструкторский ииституг пищевой промышленности (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

ИММОБИЛ ИЗОВАН Н ЫХ

ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изобрстснис относится к области получения иммобилизованных фсрмснтных препаратов и может быть использовано в пищевой промышленности» практике научных исследований.

Известен способ получения иммооилизованных фсрмснтных препаратов»а основе ферментов (липазы) или ферме»т»ых прспаратов (амилоризина Г 10 Х) связыванием Нх с сополимсром N-винилпирролидона и глицидилметакрилата путем вза»модействия при 7 — 10 С и оптимальном значении рН среды. Вссовос соотношение ф рме»т (фсрмснтный прснарат): полимер варьируется в широких пределах (1).

Однако данный способ нс обсе»счивает достаточно высокой активности и стабильности получаемого препарата (лостигасмая активность иммобилизованного амилоризина Г 10 Х составляет 2,4 ед г, а время полуинактивации при 50 С 150 мин).

Целью изобретения является увеличение активности и повышение стабильности получаемых препаратов.

Указанная цсль достигается тем, что в качестве полимера, с которым связывают фермент или фсрментный препарат, ис пользуют сополимер N-винилтиопирролидона и аллилтиоглицидилового эфира, а связывание проводят при 4 — 6 С. о

Согласно»зобрстенню, описывается, II0coc) получения нммобплизованных фермснтных нрспаратов путем взаимодействия

»ри 4 — 6 С и оптимальном значи»ии рН

5 срслы раствора фермента или фсрмснтного препарата с сополимером Х-ви»илтиои»рролилона и аллилтноглицидилового эф»ра.

Связывание обычно проводят»ри весоI Î вом соот»ошснии фермент (фсрментный препарат): полимер, равном 1: (2--8).

В качестве фермента обычно использук т трипс»» и связывание с полимером велут»р» рН 4,9---5,1, а в качестве ферментного»рс»арата используют амилоризин

Г 10 Х, связывание в этом случае ведут

I 1)è рН 3 — 4.

Описываемый способ позволяет получать иммобилизованные ферментные препа2р раты с более высокой активностью, превышающей активность препаратов, полученных известным способом в 4 — 5 раз, и более стабильные (время полуинактивации

»ри 50 С увеличивается более, чем в

2 1.5 раза).

Используемый в способе сополимер

Х-винилтиопирролндона и аллилтиоглицилилового эфира получают следующим образом. зп Соотношение мономеров N-винилтио8!07!8

3 ппрролидона (ВТГ1) и аллилтиоглицидилового эфира (ЛТГЭ) варьируют в широких пределах (m: п) от 1: 9 до 9: 1 и таким образом изменяют число групп. способных связываться с ферментами.

11апримср, смешивают 9>52 г Ж-ВТП и

3,25 г аллилтиоглицидилового эфира и к смеси добавляют 0,055 г динитрила азооиспзомасляной кислоты, растворснныс в 1 мл хлороформа, и нагревают 30 час прн 65 C.

Г!олучсшп>)й гслсобразный продукт разбавляют 25 мл хлороформа н осаждают добавлением пятикратного количества диэтилового эфира. Образовавшийся осадок высушивают в вакуумсушильном шкафу. Выхо.1 составляет 65,6%. Анализ на содсржаппс мономеров в полученном сополимерс составляет ВТП 72,7, АТГЭ 27,3", о.

1!ример 1. К 1 г сополимера ВТП—

АТГЭ добавляют 50 мл фсрмснтного раствора (амплоризипа Г 10 Х), который получают предварительным растворением

500 мг амилоризина (135 мг по белку) в

50 мл 0,1 М универсального буфера (i1„Â0;, 1I,РО4, СН СООН, КаОН) при р(! 3 -4. Смесь тщательно перемешивают п оставляют при 4 С в течение 6 час.

Полученный целевой продукт отмывают от пссвязавшсгося белка и продуктов рсакцпп О, М универсальным буферным раствором с рН 8,8. Каждую фракцию исследуют па поглощение при 645 нм на

СФ-16 и па амилолитичсскую активность (ГОСТ 20264.4 — -74) . Определяют количествоо пссвязавшсгося белка. Затем иммобилпзованный амилоризин Г 10 Х промыва1оТ во )off;Io полного исчезновения оптической плотности в промывной воде. Удельная активность иммобилизованного фсрментпого препарата составляет 10,0 сд/г.

Г1римср 2. К 800 мг соголимсра ВТП—

АТГ I добавляют 200 мг амилоризина

Г !О Х, предварительно растворе)п!ого в

50 а)л. буфера. Смесь перемешивают и оставляют при 4 С в течение 6 час.

Остальные процессы проводят аналогично примсру l.

У. )ель11ая активность иммобилпзованного фермента составляет?,2 сд/г.

Пример 3. К навескс сополимсра 1 г добавляют 50 мл фсрмсптного раствора прп рН 5>0, содсрсжащего трипсин (!25мг).

Смесь TIH,à Tåëüío перемешивают и оставля)от при 4 С в тсчепис 12 час.

Остальные операции проводят, как в прпмсрс 1. (дельная активность иммобилизованного трппсипа составляет 16 ед/г.

Время полуинактивации при 50 С

2!О мин.

В табл. 1 приведены результаты описывасмого способа п известного при получении иммобплизованнбго ферментпого препарата па основе амилоризина Г 10 Х.

Таблица 1

Ачилоризин Г )0 Х

Предлага>С>МЬ!й способ

Пок.азатель

Известный способ

Каталитическая активность, ед/г

Потери активности при иммобилизации, Время полуинактивации при 50, мпн.

Температурный оптимум, С

10.0

150

15

В табл. 2 даны результаты влпя)1пя рН среды и концентрации препарата па удсль ную активность иммобилизованпогo амплсризина Г 10 Х.

>20

Таблица 2

Концентрация ферментного препарата, 25 )ll/ !. (»P»

pl-! 8,01

Удел„н,ая активность, сд/г (на 1 г носителя), (., И с Н сl и активность, с !/г (II>I 1 г

НОСЦТСЛЯ) p){

35

Т а б.>и 1!;i 3

Ферментативный процесс

Гидролиз

ПИ>ЦСНОГ.>

Ослка

l Iupoлиз

1(Р а К М а ° с>

Пока:!атсс!1, цммобилизован им)!Оби. Ill.È>f1Ë Циый

TPf III(ff! I

> о г о о е о про . >

>ОРI 1! =— иыи ами- (>—

Время работы реактора при однократном применении фермента. час

Количество прогидролпзовав>пегося матсриала (иа г препарата,) г

Глубина гидро(и>за, %

З,О

2 1,5

2,5

652,7

117,2

2)8 4

38

Из табл. 2 следует, что иммобилизация протекает предпочтительно при рН 3 — 4, а

60 оптимальная концентрация фермента составляет 6 — 8 мг/мл.

При внедрении данного способа в производство для получения с1абильных ферментов нс требуется никаких дополнительных затрат, нс требуется дополнительная

l,0

2,0

4,0

G,0

7,0

8,0

9.0

10,0

1,04

2,60

4,20 ,6,43

6,84

4,70

3,32

1,8 ! 3,0

4,0

5,5

6,0

7,0

8,0

8,8

7,10

10.0

10,0

7,50

6,80

7,00 (,80

6,60

810?18

Составитель О. Скородумова

Техрсд А. Камышникова Корректор О. Силуянова

Редактор Л. Курасова

Заказ 2!51

Тираж 419 Изд. № 235

В IIIHHII Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, %-35; Раушская наб, д. 4/5

Г1одписиос

Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома

5 обработка для активации HocHTcлей или ферментов.

Напр1мср, при прочих равных условиях степень гидролиза крахмала при 30 С в течение 30 мин составляет по предлагаемому способу 70 /о, по известному способу

25 /о.

О преимуществах применения иммобилизованных ферментов в конкретных процсссах (гидролиз крахмала, гидролиз пищевого белка) и данные о применении иммобилизованного амилоризина для осахаривания крахмала н иммобилизованного трипсина для получения гидролизата пищсвого белка из шрота хлопчатника приведеныы в табл. 3.

Формула изобрcxcttия

1. Способ получения иммобилизованных фсрментных препаратов на основе ферментов или фермснтных препаратов связыван1км их с полимером на основе производного Х-ьчп1илпирролидона н эфира глици.и!.!Оного спирта при пониженной температуре н оптимальном значении рН среды.

o1,I и ч а го щ и йся тем, что, с целью уве

6 личения активности и повышения стабильности препарата, в качсстзс полимера используют сополимср N-винилтиопирролидона и аллилтиоглицидилового эфира, à связывание проводят при 4 — 6 С.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что связывание проводят при весовом соотношении фермент или фсрментный lIpcпарат: полимер, равном 1: (2 — 8).

3. Способ по п. 1, отлича1ощийся тем, что в качестве фермента используют трипсин, а связывание ведут при рН 4,9 — 5,1.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фермснтного препарата используют амилоризин Г 10 Х, а связывание проводят при рН 3 — 4.

Источники информации, принятые во внимание при экспсртизе

1. Гаджиев М. Х., Ибрагимов Ф.. Хасанов Х. Т., Джанбаева Н. P. и Рахимов М. М. Иммобилизация 11 стабилизаппя ферментов полимерами с функциональными эпоксигруппами. «Прикладная биохимия и микробиология», М., «Наука>;, т. XIV, вып. 5, 1978, с.703 — 708 (прототип).