Способ получения иммобилизован-ной -амилазы

Способ получения иммобилизован-ной -амилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

«» 8I07I9

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ ГВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свил-ву— (22) Заявлено 01.06.78 (21) 2621396/23-04 (51 ) М.K.1.

С 07 G 7/02 с присоединением заявки ¹â€” йкударственный комитет (23) Приорптет— (43) Опубликовано 07.03,81. Бюллетень ¹ 9 (45) Дата опубликования описания 07.03.81.

1е яеяам изобретений и отквытнй (53) УДК 577 15 07 (088.8) (72) Авторы изобретения A K. Арен, Г. И. Квеситадзе, М. Ш. Двали, Т. Ш. Гвалия, И. В. Грузннь, И, А. Вина и P. A. Мелнгалве (7! ) Заявитель

1 (54) СПОСОБ ПОЛ УЧ ЕН ИЯ

ИММОБИЛ ИЗОВАН HOA iz-АМИ ЛАЗЫ

Изобретение относится к способу получения иммобилизованной а-амилазы, используемой в ряде отраслей промышленности, в частности в пищевой при производстве кристаллической глюкозы нз крахмала, производстве плодово-яго (Hhlx соков, пивоварении и з других областях.

Известно несколько способов получения иммобилизованной а-амилазы с использованием в качестве матрицы акрильных по- !0 лимеров 11) производных целлюлозы 2, фильтровальной бумаги типа %atman 1!31.

Наиболее близким по технической суш,ности и достигаемому положительному эффекту является способ получения иммоби- !5 лизованной а-амилазы, в котором в качестве матрицы для иммобилизации используют бумагу типа Watman 1. активиоованную TiC13 f3).

Способ включает активацию матрицы 90 трихлоридом титана при 44 — 46 С в течение суток и связывание с ней фермента в среде 0,02 М ацетатного буфера (рН 5,5) при 20 С в течение часа. Получают препарат иммобилизованной а-амилазы с актив- 25 ностью 54 ед/г.

Однако данный способ имеет относительно низкую активность иммобилизованной а-амилазы и ее невысокую стабильность (подверженность микробиальному 30 поражению и низкая механическая прочность) .

Целью изобретения является повышение активности и увеличение стабильности иммобилизованной а-амилазы.

Указанная цель достигается тем, что в качестве матрицы используют неорганический Si-содержащий материал (обычно силохром или силикагель), а связывание фермента осуществляют при рН реакционной среды 4 5 — 4.7 и в присутствии 0,05 М ацетата кальция, причем в случае применения для активации матрицы тетрахлорида титана активацию проводят при 3 — 5 С в течение 30 — 40 мин с последующим прокаливанием при 535 — 540 С в течение часа и связыванием фермента при 3 — 5 C в течение 19 — 20 час, а в случае применения для активации трихлорида титана связывание фермента с активированной матрицей проводят в течение 2 час.

Согласно изобретению описывается способ получения иммобилизованной а-амилаз4 путем активации неорганической Si-содержащей матрицы трихлоридом или тетрахлоридом титана и связывания фермента с активированной матрицей в среде ацетатного буфера рН 4,5 — 4,7 в присутствии

0,5 М ацетата кальция, причем активацию матрицы тетрахлоридом титана осуществ810719

3 ляют при 3 — 5 С в теченис 30 — 40 мин с послсду(ощнм прокаливанисм при

535- 540 C в течение часа и связы(3анис(( фермеHTB при 3 †-5"С в течение 19 — 20 ч, B связывание фермента с матрицсй. активпрованной трихлоридом титана, осущсствля!от в тсчсiflic 2 час.

Активацию матрицы трпхлоридом титана ооычно осуществляют при 44 — 66 C в течение суток.

Описывае 1 bilf чпть пммобилизованную сс-амилазу с выcoIioif активносrbio lo 480 cg/1 носителя.

Иммобилизованпая данным способом сс-амплаза обладает так)кс высокой стаб1fльностью. ранение фермснтного препарата при рН 4,7 и 4"C в течение года, а также пятпдссятикратпос повторение специфической реакции па 1,3 и 1О о-ном растворимом крах)(ало с меняет активности иммобилизова нного фср>>(снтс(.

Это обуславливается прпмспспнсм в качестве матрицы активир013анпых сОлями титана нсоргапичсских 81-содержащих материалов (силохрома и силикагсля), облекавшиx высокой удельной поверхностью, что обсспечиваст высокую активность 110лучснпого иммобилизова нного фермента.

Высокая микробиальная стойкость и механическая прочность силохромов и силикагслсй обеспечивает высокую стабильность иммобилизованных даниьв(способом х-амилаз.

I fl fi I(a i; Cl)If3bIf3B f! If((!) с!) )ICIITBc !

3(. f) Х(!()>(т!>fo а! Т!(В(>PÎ(3à > :1«()Й СО и >|П I И ;!

f(a мат )Hilbi проводят I3 нрисутстш(и апстаf aI Ka l f>LfIIH, !(Ск 1(ОЧ астСЯ Ионн ыИ ОО)((. if мс)кду я-амилазой, которая содержит в свocй мо.(скуле ион Са, и повсрхности(мп ионами H: сплохромов и силпкагслсй.

Гlрисутств!ис иона Са в молекуле R-амплазы обеспечивает се фермснтную актпвHocTI, а добавление апетата кал!И(ия во время иммобилизации с(,-амилазы г(озволяст сохранить высокую активносп npcnapaTo!3. !(Онцентрац!!я апетата кали!1.1(((0,05 М является оптимальной, так как далы(сйшсс повышение концентрации нс способствус) повышению активности иммобилизованного фермента. Установление рН среды в пределах 4,5 — 4,7 также способствует повышению активности полученных препаратов.

В качестве я-амилаз для иммобилизации можно использовать <х-амилазы грибного (Asp. oryzae) и бактериального (Вас. SLfbtilis) происхождения. В качестве макропористых кремнеземов можно использовать силохромы и силикагели различных марок.

Пример 1. 1 г силикагсля МСЛ-750 заливают 5 мл 12,5"/О TiC13, растворенного ь абсолютном этиловом спиртс, интенсивно перемешивают и выдержива|от 24 часа при

45, затем реакционную смесь фильтруют, носитель промывают (трижды) 1 í. NaCl, 4 ои.(исти:ICIHPOIIBHHOÉ вОдой ((()ad((3bf)

0,02 М ацетатным буфером (трижды) рН 4,7.

Активированный носитель инкубиру|от с 20 мл ферментного раствора, содержащего 80 мг фермента ()3-амилазы Asp. oryzас, в 0,02 М ацетатном буфере (pH 4,7) в присутствии 0>05 М ацетата кальция.

Умеренно перемешивают при 20 С, 2 час. () !ммобилизованный фермент отфильтровывают и промывают ацетатным буфером, рН 4,7 (трижды), затем 1 и. NaC (трижДbl) H 0H;IHcTH IlHPOI3BHHOÉ 130,TOÉ. /(KTHI3 ность иммобилизованной а-амилазы 445 сд/I (5 ((оситсля.

Активность иммобилизованной х-амилазы. определяют по методу Рухлядевои A. П. и Горячевой М. Г.

Пример 2. 1 г силохрома CX-2,5 зали2() ва(от 5 мл 12,5% TiCI>b растворснпо|о г, абсолютном этиловом спиртс, интснсивно перемешивают и выдерживают 24 час пои

45 С, затем реакционную cilccf фильтруют, носитель промывают (трижды) 1 и.

25 NaCI, бидистиллированной водой (äâa>êIbl) и 0,02 М ацетатным буфером (трижды) р! 4,7.

Лк i ilaHPQBBHHbIH носитель и(IКУОиРУIОт с 20 мл фсрментного раствора, содсржа30 щего 100 мг фермента сс-амилазы Asp. oryzac в 0,02 М ацстатном буфере (pl! 4,7) в ((рисутств;(и 0,05 апстата кальция. Умеренно перемешивают при 20 С, 2 ч. Иммобилнзоваш(ый фермена отфильтровываю г

35 и промывают ацстатным буфером, рН 4,7 (трижды), затем 1 н. МаС! (трижды) и ohдистиллированной водой. Af

Пример 3. 1 г силохрома СХ-2,5 сус40 пендируют в 5 мл дистиллированной водь( нрп 4 -С и порциями по 0,1 мл через каж(ыс 5 мин добавляют при интенсивном и рсмсшивании 0,5 мл TiCIq, Через 40 чп.посптсль отделяют, промывают 0>01 и. HCl, 45 затем бидистиллированной водой 10 ней(ральной реакции и прокали(3аюг 1 час при 540"С.

Акти вированн ый носитель ин кубирую-. с 20 мл фсрментного раствора, содержаще50 гo 100 мг фермента я-амилазы Asp. огуzac. в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция. Умеренно перемешивают в течение 20 час. при 4 С. фильтруют и промывают ацетатньв| буфс55 ром, рН 4 5 (трижды), затем 1 н. 4аС! (три)кды) и бидистиллированной водой.

Активность прспарата 353 ед/г носителя.

Гlримср 4. 1 г силохрома СХ-2,5 суспсн6() дируют в 5 мл дистиллированной воды при

4 С и порциями по 0,1 мл через каждь!с

5 мин добавляют при интенсивном перемешивании 0,5 мл Т!С14. Через 40 мин носитель отделяют, промывают 0,01 н. НС1, заf65 тем бидистиллированной водой Io нейт10719

30

8

5 ральной реакции и прока IHBafoT час при

540" С.

Лктивированиыи г1оситсль HklKyбиру1от с 20 мл ферме ITHofo раствора, содержащего 100 мг фермента а-амилазы Asp, ol yzac, в 0,1 М ацетатном буферс (рН 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция.

Учсрснно перемешивают в теченис 20 час при 4 С, Фильтруют и промывают ацстатпыч буфером, рН 4,5 (трижды), затем l if.

ХaCI (трижды) и бидистиллированной во,tOii.

Активность препарата 337 сд/и носителя.

Пример 5. 1 г силохрома С-80 заливают 5 мл 12,5 /О TiCIq> растворенного в абсолютном этиловом спирте, интенсивно перемешивают и выдерживают 24 час при 45", затем реакционную смесь фильтруют, носитсль промывают (трижды) 1 н. iNaC!, бидистиллирова иной водой (дважды) и

0,02 М ацетатным буфером (трижды), рН 4,7.

Активированный носитель инкубпруют с 20 мл ферментпого раствора, содсржа1цего 100 мг фермента J.-ампла 51 Вас. sUbIilis (Препарат Амилосубтилин Г-10Х, производимый в г. Вильшосс) в 0,02 М апетатном буфере (рН 4.7) в присутствии

0,05 М ацетата кальция. Умеренно перемешивают при 20 С 2 ч, фильтруют и промывают ацетатным буфером, рН 4,7 (трижды), затем 1 H. NaCI (три>к,1ы) и бидистиллированной водой. Активность препарата 340 сд/г носителя.

Пример 6. 1 г силохрома С-120 заливают 5 мл 12,5" .TICI>, растворенного в абсолютном этиловом спирте, интенсивно перемешивают и выдерживают 24 час при 45 С, затем фильтруют и промывают (трижды)

1 и. NaCI, бидистиллированной водой (дважды) и 0,02 М ацетатным буфером (трижды), рН 4,7, Активированный носитель инкубируют с 20 мл фсрментногo раствора, содержащего 80 мг фермента а.-амилазы Вас. stibЫis, в 0,02 М ацетатном буфере (рН 4,7} в присутствии 0,05 М ацетата кальция.

Умерсн11о перемешивают при 20 С 2 час, фильтруют, промывают ацетатным буфером рН 4,7 (трижды), затем 1 и. NaC1 (трижды) и бидистиллированной водой.

Лктивность препарата 359 ед/г носителя.

Пример 7. 1 r. силохрома СХ-2,5 .заливают 5 мл 12,5% TiC13, растворенного в абсолютном этиловом спирте, интенсивно перемешивают и выдерживают 24 час при

45 С, затем фильтруют и промывают (трижды) 1 и. NaCI, бидистиллированной водой (дважды) и 0,02 М ацетатным буфером (трижды), рН 4,7.

Лктивированный носитель инкубируют с 20 мл ферментного раствора, содержа1цсго 80 мг фермента я-амилазы Вас. suhtilis, в 0,02 М ацетатном буфере (pH 4,7! в присутствии 0,05 М ацетата кальция.

Умеренно перемешивают при 20 C " час.

Фильтруют, промывают ацетатным буфером, рН 4,7 (трижды), затем í. NaCI (трижды) и бидистиллированной водой.

Активность препарата 400 ед/г носителя.

Пример 8. 1 г силикагеля МСЛ-750 суспсндируют в 5 мл дистиллированной воды при 4 C и порциями по 0,1 мл через каждыс 5 мин добавляют при интенсивном перемсшивании 0.5 мл Т1С!4. Через 40 мин носитель отделяют, промывают 0,01 н. HCI, а затем дистиллированной водой до нейтральной рсакции и прокаливают 1 час при 540 " С, Активированный носитель инкубируют с 20 мл ферментного раствора, содержа1цсго 100 мг фермента а-амилазы Вас. з11Ьtilis, в 0,1 М ацстатном буфере (рН 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция.

Умеренно перемешивают в течснис 20 час при 4 С. Фильтруют и промывают ацетатItDi буфером, рН 4,5 (трижды), затем 1 н. ! аС! (трижды) If бидистиллированной водой. Активность препарата 480 сд г носителя.

Причср 9. 1 г силикагеля МСЛ-1500 суспсндпруют в 5 мл дистиллированной воды прп 4=С и порциями по 0.1 мл vepca каждыс. 5 мин добавляют при пнт HcH30031 перемешиванпп 0,5 мл TiC14. Через i0 мип носитель отделяют, промывают 0,01 н. НС1, а затем бидистиллированной водой до нейтральной реакции li прокаливают час при 540 С.

Лктивированный носитель пнкубнруют с 20 мл ферментного раствора, содержащего 100 мг фермента х-амилазы Вас. sUhtilis. в 0,01 М ацетатпом буфсрс рН 4,5 в присутствии 0,05 М ацетата кальция.

Умеренно перемешивают в течение 20 час при 4 С, фильтруют и промыва1от ацетатным буфером, рН 4,5 (трижды), затем 1 н. .,аС! (трижды) и бп,цзстиллированной водой, Активность препарата 390 ед/г носителя.

Пример 10. 1 г силикагсля МСЛ-2500 суспендируют в 5 мл дистиллированной воды прп 4 С и порttиячи пo О,! мл Icðoç каждые 5 мин добавляют при интенсивном пере tcIIIHBBHHH 0,5 мл Т1С!4. Через 10 мин носитель отделяют, промывают 0,01 и. HCI, а затем дистиллированной водой до нейтральной реакции и прокалива1оч 1 час при 540 С.

Активированный носитель инкуоируюг с 20 мл ферментного раствора, содержащего 100 мг фермента я-амилазы Вас. subtilis, в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,5) в присутствии 0,05 М ацетата кальция.

Умеренно перемешивают в течение 20 час при 4 С, фильтруют и промывают ацетатным буфером, рН 4,5 (трижды), затем и.

МаС! (трижды) и бидистиллированной водой. Активность препарата 325 ед/г носителя.

810719

Составитель О. Скородумова

Техред А, Камышинкова

Редактор Л. Курасова

Корректор О. Силуянова

Тираж 419 Изд. М 235

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Заказ 2151

Подписное

Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованной к-амилазы, включающий активацию нерастворимой матрицы хлоридом титана и связывание фермента с активи ров анной матрицей в среде ацетатного буфера, о тличающийся тем, что, с целью повышения активности и увеличения стабильности целевого продукта, в качестве матрицы используют неорганический Si-содеркаший материал, а связывание фермента осуществляют при рН реакционной среды 4,5 — 4,7 в присутствии 0,05 М ацетата кальция, причем активацию матрицы тетрахлоридом титана осуществляют при 3 — 5 С в течение

30 — 40 мин с последующим прокаливанием при 535 — 540 С в течение часа и связыванием фермента при 3 — 5 С в течение

19 — 20 час, связывание фермента с матрицей, активированной трихлоридом титана, осуществляют в течение 2 час.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неорганического Si-coдержащего материала используют силохром или силикагель.

3, Способ по п. 1, отличающийся тем, что активацию матрицы трихлоридом титана осуществляют при 44 — 46 С в течение суток.

Источники информации, 10 принятые во внимание при экспертизе

1. $. А. Barker, Р. J. Son!ers, R. Epton, «Recovery and re-use of water-insoluble amylase derivatives», Carbohyd. Res., 1970, го1. 14, 3, 323.

2. $. А. Barker, P. J. Sorners, R. Ер1о11, «Preparation and propert!es of а-au!ylasc

chemically coupled to mycrocrystall inc сс1lulose», Carbohyd. Res., 1968, vol. 8, 491.

20 3. А, A. Emery, G. S. lough, М. Xovais, T. P. Lyons, «$огпе applications oi solidрhase cnaymes in biological engineering», «Thc Chemical Engineering», Геогцагv, 1972, 258, 71 — 76 (прототип) .