Способ получения модифицированнойрибонуклеиновой кислоты

Способ получения модифицированнойрибонуклеиновой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

SI0725

Соаа Советских

ОПИСАНИЕ

ИЗО БР ЕТЕ Н И Я

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Социалистических

Респуолнк 1о ()г

« (61) Дополнительное к авт. синд-ву— (22) Заявлено 31.07.78 (21) 2652649/23-04 (51) М. 1(л."

С 07 Х 21/00 с присоединением заявки ¹â€”

Государственный комитет (23) Приоритет (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллетень ¹ 9 (45) Дата опубликования описания 07.03.81 ло делам изобретений и открытий (53) х ДК 577.15.07 (088.8) (72) Авторы изобретения

Б. М. Куриненко, P. Э. Давыдов и

Ф. Ф. Ш аги-Мух а мето еа

Казанский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина (71) Заявитель (54) СПОСОБ floËÓ×ЕИИЯ

МОДИФИЦHPOBAH HOA

РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в энзимологии при исследовании ферментов нуклсинового обмена и при получении иммо билизованных ферментов.

Полимерные лиганды, специфически взаимодействующие с активным центром фермента, являются черезвычайно полезным инструментом для аналитического исследования каталитических свойств ферментов и для решения ряда прикладных задач. 8 частности, возможно их применение для зашиты активного центра при иммобилизации ферментов. Это дает возможность ориентировать иммобилизацию и увеличить выход иммобилизованных фсрмснтов llo активности.

Одним из походов для создания таких лигандов является ковалентное связывание с полимерным носителем субстрата, сохраняющего после связывания способность к взаимодействию с ферментом.

Известен способ IIo, ÷ó÷åíèÿ иммобилизованных нуклеиновых кислот путеM ковалснтного связывания их на холоду в течение 30 мин с растворимым полимером декстрана полиглюкином с помощью цианурхлорида обработкой смеси нуклеиновой кислоты (РНК . или ДНК) и полиглюкина ацетоновым раствором цнанурхлорида для ЗО

2 получения на их основе аффинного сорбента, взаимодействующего с нуклеазами без существенного выщелачивания нуклеиновой кислоты 111.

Помимо целевого продукта в качестве побочного продукта реакции получают модифицированные нуклеиновые кислоты (ДНК или РН1(), являющиеся водорастворимыми высокомолекулярными лигандами нуклеаз (выход менее 20%) и представляющие большой практический и теоретический интерес.

Данный способ осуществляется следующим образом.

К 0,3%-ному раствору рибонуклеиновой кислоты в 5%-ном растворе декстрана добавляют по каплям на холоду ацетоновый раствор цианурхлорнда до конечной концентрации 2%. В процессе добавления раствора цианурхлорида образуется белый гель. Нерастворимый конечный продукт —нолисахарид, ноперсчно сшитый с нуклеиновой кислотой, отмывают от исходных нспрорсагировавших компонентов и используют в качестве аффинного сорбента. Полученный по описанному .способу лиган нерастворим, что ограничивает его применение областью аффннной хроматографин

Выход же растворимого лнганда -- моди810725 фицированных нуклеиновых кислот недостаточно высок (менее 20 /o).

Целью изобретения является увеличение выхода растворимого лиганда, а также отделение сго от побочных продуктов синтеза.

Поставленная цель достигается согласно описываемому способу получения модифицированной рибонуклеиновой кислоты, заключающемуся в связывании PHI(с полиглюкином с помощью цианурхлорида в течение 24 ч при 20 — 25 С путем обработки 1,5 — 2 /о смеси РНК и поли люкина ацетоновым раствором цианурхлорида (прн концентрации его в смеси 0,05 — 1 о), с последующим удалением водонерастворимых продуктов реакции, диализом против

0,05 М трис-НСI буфера рН 7,0 — 7,5 и сслективным извлечением целевого продукта аффинной хроматографией.

Существенными отличиями данного способа являются низкие концентрации реагирующих веществ, условия связывания — в течение 24 ч при 20 — 25 С, диализ н селективное извлечение целевого продукга, провод«мыс в указанных выше условиях.

При осуществлении способа весовое соотношение РНК и полиглюкина обычно составляет 1: 10, а в качестве аффинного сорбента используют рибонуклсазу, иммобилизованную на оксиэтилсульфониланпзолцеллюлозе.

Описываемый способ обеспсч«наст более высокий выход модифицированной

РНК, а также высокое качество продукта. достигаемое за счет применения в целях очистки и выделения афинной хроматографии.

Модифицированная PI-IК, получаемая описываемым способом, сохраняет способность к повторному взаимодействию с ферментом и может быть использована в качестве специфического ингибитора 1Ч1Казы.

Молекулярный вес лиганда может колебаться в широких пределах (в зависимости от молекулярного веса носителя), это может быть использовано для получения комплексов пнгибитор-РНКаза и ьыделения фермента из сложной смеси белков с близкими физико-химическими свойствами методом эксклюзионной хроматографии.

Способность образовывать достаточно прочные комплексы с ферментом может быть использована для защиты активного центра фермента при его иммобилизации, При этом увеличится выход иммобилизованных ферментов. по активности и, естест-: венно, возрастет экономическая эф:.рективность иммобилизации. Иммобилизованные на растворимых носителях ферменты обладают более высокой биологической активностью, и их целесообразно использовать в качестве лекарственных препаратов по сравнению с нативными ферментами.

Пример 1. 500 мг полиглюкина раство5

4 ряют в 25 мл 0,1 М боратного буфера, рН 9,2, в полученном растворе растворяют

50 мг РНК, смесь охлаждают до 5 . Далее добавляют 10 мл охлажденного раствора цианурхлорида в ацетоне (2,5 мг/мл). Tev.пературу смеси доводят до комнатной, выдерживают в течение 24 ч. Водонерастворимые продукты отделяют фильтрованием.

Водорастворимый продукт, выход которого составляет более 40 /о, далее отдиализовывают против 0,05 М трис-HCI буфера, рН

7,0 — 7,5 до удаления низкомолекулярных примесей, поглощающих при 260 нм.

Диализат наносят на колонку с иммобилизованной на оксиэтилсульфониланизолцеллюлозе РНКазой в соотношении

25 опт. сд. на 100000 ед. акт. иммобилизованного фермента. Активность исследуют методом определения продуктов гидролиза РНК, растворимых в кислом растворе уранилацетата (конечная концентрация—

0,12% уранилацетата в 4 /о НС10„). За единицу активности принимают количество фермента, образующего 1,0 опт. ед. кислоторастворимых продуктов гпдролпза РНК в течение 1 часа инкубацп«реакционной смеси. Колонку промывают 0,05 М трис-НС1 буфером рН 7,5 и водорастворимый лиганд

РНКазы элюируют 0,2 М ацетатным буфером, рН 5,2.

Пример 2. Использование модифицированной РНК в качестве ингибитора

РНКазы.

Ингибирующсс действие модифицированной РНК (высокомолекулярного лиганда) определяют по торможению реакции гндролиза РНК в присутствии модифицированной РНК с помощью метода измерения количеств кислоторастворимых продуктов гидролиза.

Реакционную смесь, состоящу.о из

0,1 мл РНК (концентрация 1 мгlмл), 0,1 мл фермента — панкреатической РНКазы и

0,1 мл ингнбитора, инкубируют при 37 C в течение 5, 10, 15 мин. Затем к ней при охлаждении (О С) добавляют 0,3 мл 0,075%ного раствора уранилацетата в 10 /о-ной хлорной кислоте. Смесь выдерживают на льду в тсчснис 10 мин. Далее добавляют

1,9 мл 2,5 /о-ного раствора хлорной кислоты н отделяют осадок цснтрифугированисм при 7000 об/мин в течение 10 мип.

Оптическую плотность надосадочной жидкости измеряют при 260 нм. 3а единицу активности принимают количество фермента, образующего 1,0 опт. единиц кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК в течение 1 ч инкубации реакционной смеси.

Наличие в реакционной смеси модифицированной РНК в соотношении к натиг; ной, как 1: 20, вызывает торможение реакции гидролиза íà 50/ю.

810725

Составитель О. Скородумова

Техред А. Камышникова корректор О. Силуянова

Редактор Л. Курасова

Подписное

Тираж 4!9 Изд. М 235

ИНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

i l3035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/Ь

Заказ 2 ) .

3 гопская типография Упрполиграфиздата Мособлислолкома

Формула изобретения

1. Способ получения модифицированно "l рибонуклеиновой кислоты (РНЕ,) путем .обработки смеси РНК и полиглюкина ацетоновым раствором цианурхлорида, о т л ич а и шийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, используют цианурхлорид при концентрации его в реакциеип!ой смеси 0,05 — 1 !о, РНК и полиглюкина 1,5 — 2 /о, связывание осуществля!от в течение 24 ч при 20 — 25 С с последующи» удалением водонерастворимых продуктов реакции, диализом против 0,05 М трис-НСI буфера, рН 7,0 — 7,5 и селективным извле:б чением целевого продукта аффиниой хроматографией.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что весовое соотношение PHD и поли5 глюкина в реакционной смеси составляет

1: 10.

3. Способ по и. 1, о т л и ч.а ю шийся тем, что в качестве аффинного сорбент используют рнбонуклеазу, иммобилизованl0 ную на оксиэтилсулъфониланизоцеллюг!озе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство ССС Р

Мо 6I8380 кл С 67 Н 21l00, 1.976 (про-!

5 тотип).