Способ окрашивания хромосомрастений

Способ окрашивания хромосомрастений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ CB ТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (a)812240 (6 f ) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 2 70679 (23) 2788652/30-15 (з() м. кл.

A H 1/00 с присоединением заявки Йо (оеударствениый комитет.СССР яо делам нзобретеийй к открытий (23) Приоритет

Опубликовано 150381 Бюллетень t4o 10 ($3) УДК 578.65 (088 ° 8) Лата опубликования описания 1 503/ 1

P2) Автор изобретения

Ю.М. Агаев .Институт генетики и селекции

AH Азербайджанской ССР

P 3) Заявитель (54) СПОСОБ OKPAOIHBAHHH ХРОМОСОМ РАСТЕНИЙ

Изобретение относится к цитологии растений, а именно к технике окрашивания хромосом растений и изготовления давленых препаратов.

Известны способы окрашнвания хромосом растений, при которых используют ацето-карминовые, ацето-лакмоидные, ацето-железо-гематоксилиновые красители, производят фиксацию по

Карнау гидролиз в соляной кислоте(1).1О

Однако известные способы не при,годны для окрашивания определенных так сономических групп растений и не всегда позволяют получать ясное представление о морфологии хромосом, f5

; Известен также способ окрашивания хромосом шелковицы, при котором эафйксированный по Карнау материал подвергают гидролизу в соляной кислоте. при различных температурных режимах, 29 после чего промывают в 45%-ной уксус ной кислоте в течение 25-30 мии., окрашивают ацето-железо-гематокоилином при 29-30 С в течение 8-12 ч,, нрополаскивают в 45%-ной пропионовой 2з кислоте, помещают в каплю этой кислоты и готовят давленый препарат (2).

Способ, разработанный для окраши вания метафазных хромосом диплоид- t .ных и полиплоидйых форм шелковицы, я применительно к другим растениям, как правило, мало пригоден, хромосомы или окрашиваются в недостаточной степени, или черезмерно интенсивно, что делает невозможным изучение их морфологии ° Материал после окрашивания ацето-железо-гематоксилином зачастую эатвердевает, плохо дав утся или не давится вовсе ° Поэтому на изготовленных давленых препаратах клетки плохо распластываются, не получается хорошего разброса хромосом. Последние лежат скученно и не в одной плоскости, Промывание материала от соляной кислоты 45%-ной уксусной кислотой создает некоторые неудобства в работе, связанные с необходимостью принятия дополнительных мер техники безопасности по защите от попадания паров кислоты в дыхательные пути исследователя, от загрязнения кислотой рабочего места и т. д.

Цель изобретения — достижение интенсивного и четкого окрашивания хромосом различных растений .на фоне бесцветной или слабоокрашенной плазмы на давленых препаратах, обеспечения хорошего распластывания клеток и расположения хромосом разрозненно, в одной плоскости.

812240

ЗО

Поставленная цель достигается тем, что зафиксированный одним иэ спиртовых фиксаторов, преимущественно по

Карнау, растительный материал (лис, точкй, корешки, пыльники на стадиях мейоза и т.п.), хранящийся в 70%-ном . 5 спирте, после гидролиэа в 1 н соляной кислоте в течение 8-12 мин при

60 С промывается от НС1 помещением в буферный раствор 2хББС, (РН 7,0), который представляет собой раствор, содержащий 0,3 M хлористого натрия и 0,03 М цитрата натрия трехзамещенного, на 25-30 мин, который эа указанное время сменяется не менее трех раэ. Затем материал помещается в . 15 о ацето-железо-гематоксилин при 29-30 С от 1-2 ч до 2 сут в зависимости от вида растения. Корешки и пыльники злаков выдерживают в красителе: инжир 1-2 ч, гранат 16-24 ч, виноград 2О

2 сут и т.д, После окрашивания материал промывается от красителя дистиллированной водой 10-1 5 мин, освобождается. от ненужных частей, помещается в маленьком герметически закрытом сосуде в цитазу на 1,5-3 ч при

20-25оС, промывается от цитаэы дистиллированной водой 5-10 мин и гото-. вится давленый препарат в капле просветляющей жидкости (45%-ной уксусной кислоты, смеси глицерина и насыщенного водного раствора хлоралгидрата и т.п.). Если исследуется растение, хромосомы которого склонны к обесцвечиванию в названных средах, то давленый пРепаРат готовится в кап-, 35 ле 45%-ной пропионовой кислоты. Образцы некоторых растений (например, элаковых) после промывки от цитазы дистиллированной водой выдерживаются

3-10 мин в 45%-ной уксусной кислоте и давленый препарат готовится в капле этой же кислоты.

При надобности материал в цитазе можно оставлять:до 1-3 сут в холодильнике без заметного ухудшения качества изготовляемых препаратов. 45

Изготовленные выаеуказанным способом препараты различных растений содержат хорошо распластанные клетки с интенсивно и четко окрашенными хромосомами, расположенными в метафаз- 5О ной пластинке разрозненно и в одной плоскости. Плазма или не окрашивается или же окрашивается очень слабо.

«Пример 1. Корешки проростков пшеницы, эгилопса, ржи и эгилопсаржаного гибрида предобрабатываем насыщенным водным раствором монобромнафталина в течение 3 ч, промываем в проточной воде 30 мин, фиксируем по Карнау (б:3:1) в течение 24 ч, промываем 96 и 70%-ными спиртами и помещаем в 703-ном спирте в холодильник. Корешки хранящиеся в 70%ном спирте, переводим в 1н . соляную кислоту при 60 С на 10 мин, тщатель но промываем от соляной кислоты.бу 65 ферным раствором 2х ББС(РН 7,0) в течение 25-30 мин, сменяя буфер свежим не менее трех аз, помещаем в свежеотфильтрованный ацето-желеэогематоксилин при ЗООC на 1 ч 40 мин.

Затем корешки промываем 10 мин в нескольких сменах дистиллрованной воды, отрезаем кончики корешков длиной 1-1,5 мм, оттягиваем из них излишки воды Фильтровальной бумагой и помещаем в небольшую каплю цитазы в маленьком фарфоровом тигле. Тигель с материалом плотно закрываем корковой пробкой и помещаем в термостат с температурой 25 С, Через -1,5-2 ч кончики корешков по одному вынимаем из цитаэы микролопаточкой, осторожно помещаем в дистиллированную воду для удаления цитазы. Через 5-6 мин кончики корешка помещаем на 3-10 мин в каплю 45%-ной уксусной кислоты на предметном стекле, предварительно убрав излишки воды фильтровальной бумагой. ГотовиМ давленый препарат.

Пример 2. Корешки укорененных черенков инжира, граната и винограда фиксируем по Карнау (б:3:1) в течение 24 ч, промываем 96%-ным спиртом и храним в 70Ъ-ном спирте в холодильнике. Корешки, хранящиеся в спирте, обрабатываем 10 мин 1 н раствором соляной кислоты при 60 С, промываем от НС1 буфером 2хББС(РН 7,0) в течение 30 мин, трижды сменяя буфер свежим. Затем корешки выдерживаем в ацето-железо- гематоксилине при 30 С в течение 20 ч (корешки инжира и граната) и 2 сут (корешки винограда) . После этого их промываем водой в течение 10 мин, осторожно снимаем с кончиков корешков под микроскопом МБС-1 ризодермис с чехликом.

Очищенные от ризодермиса и чехлика кончики корешков длинбй 1-1,5 мм помещаем в цитазу на 2 ч в маленький фарфоровый тигель, который плотно закрываем корковой пробкой и помео щаем в термостат с температурой 25 С.

Через 2 ч кончики корешков по одному вынимаем из цитаэы и перекладываем в дистиллированную воду на 5 мин.

Затем кончик корешка давим на предметном стекле в капле 45%-ной пропионовой кислоты.

Ацето-железо-гематоксилин готовится по известному рецепту: 4 г гематоксилина растворяется в колбе в. 100 мл 45%-ной уксусной кислоты, затем добавляется 1 г железо-аммонийных квасцов, Колба неплотно закрывается ватной пробкой и оставляется в теп:лом (26-30 C),светлом месте на 4-5 сут для созревания красителя. При температуре ниже 25оС созревание длится 7-10 и более сут. После созревания краситель фильтруется через бумажный фильтр и хранится в холодильнике. Такой краситель сохраняет свои красящие свойства около месяца

812240

Формула изобретения

Составитель Л, Марченкова

Танкред Н.Майорош Корректор С. Щомак ь

Редактор Н. Минко

Тираж 700 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Заказ 603/3

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул Проектная, 4

Хромосомы злаковых культур хорошо красятся и красителем, со времени .приготовления которого прошло более чем один месяц.

Буфер 2xSSC представляет собой раствор, содержащий 0,3 М хлористого натрия и 0,03 М цитрата натрия трехзамещенного, рН доводят до 7,0 путем прибавления по каплям 1н соляной кислоты.

Использование предлагаемого способа окрашивания хромосом растений обеспечивает по сравнению с известными способами исключительно четкое, интенсивное окрашивание хромосом различных растений на фоне бесцветной или слабоокрашенной плазмы, в том числе, интенсивное и четкое окрашивание хромосом на фоне слабоокрашенной плазмы даже у тех растений, хро мосомы которых всеми известными способами окрашиваются явно неудовлетво- 20 рительно (например, у винограда, инжира, граната и т.д.); избирательность в окрашиваниии соматических метафазных хромосом различных растений, облегчающую исследованием морфологии этих хромосом и их идентификацию; несравненно лучшее распластывание клеток в давленых препаратах с расположением хромосом разнозненно

a в одной плоскости; избавление иссле- о дователя от мер предосторожности, связанных с опасностью загрязнения рабочего места концентрированной уксусной кислотой и попадания паров этой кислоты в дыхательные пути. При регулярно проводимой круглогодичной цитологической работе эта опасность особенно велика. Применение буфера

2х SSC вместо 45%-ной уксусной кислоты имеет еше то преимущество, что при этом лучше выявляются центромеры, 40 вторичные перетяжки, спутники, а также двуххроматидная структура каж-, дой хромосомы.

Способ окрашивания хромосом растений, включающий фиксацию спиртовьм фиксатором, гидролиз в 1 н растворе НС1 при 60оС и окрашивание ацетожелезо-гематоксилином, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью достижения интенсивного и четкого окрашивания хромосом различных растений на фоне бесцветной или слабоокрашенной плазмы на давленых препаратах, обес печения хорошего распластывания клеток и расположения хромосом разрозненно, в одной плоскости, окрашиваемый материал после спиртовой фиксации и гидролиза промывают от НС1 не менее трех раз буферным раствором

2xSSC в течение 25-30 мин, выдерживают в ацето-железо-гематоксилине при 29-30 С от 1-2 ч до 2 сут в заО висимости от вида растения, после чего промывают 2-3 р в течение 10-15 мин дистиллированной водой, помещают в цитазу на 1,5-3 ч при 20-25 С в герметически закрытых сосудах, промывают от цитазы дистиллированной водой в течение 5-20 мин, выдерживают в 45%-ной уксусной кислоте в течение 3-10 мин и готовят давленый препарат в капле этой же кислоты.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Паушева З,П. Практикум по цитологии растений. М., "Колос", 1974, с, 119-127, 176-181.

2 ° Авторское свидетельство СССР

9 652931, кл. A 01 Н 1/00, 1977 (прототип) .