Способ получения рибонуклеазы

Способ получения рибонуклеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕ- АЗЫ путем экстрагирования печени рыб кислым водньм раствором с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония, обессоливанием и очистки, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве источника сырья используют печень минтая и очистку осуществляют на фосфоцеллюлозе и затем дополнительно рехроматографируют на том же сорбенте.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (11) (д) 4 А 61 К 35/60

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

И ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТЭЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2863979/28-13 (22) 05.12.79 (46) 30.03.86. Бюл. N- 12 (71) Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного научного центра АН СССР (72) Ю.B.Федосов и В.А.Рассказов (53) 615.45:615.34(088.8) (56) Comp. Biochem. Physio ., 1972, чо С. 41В, рр. 263-275. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕАЗЫ путем экстрагирования печени рыб кислым водньи раствором с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония, обессоливанием и очистки, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве источника сырья используют печень минтая и очистку осуществляют на фосфоцеллюлозе и затем дополнительно рехроматографируют на том же сорбенте.

1 8

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается производства ферментных препаратов.

Известен способ получения рибонуклеазы путем экстрагирования печени рыб кисльу водным раствором с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония обессоливанием и очисткой.

Однако известный способ.не обеспечивает высокого выхода рибонуклеазы.

Известным способом получают 1,3мг рибонуклеазы (по белку), что составляет 23Х от активности сырого ферментного препарата. Очистка фермента достигнута в 96 раз.

Цель изобретения — увеличение выхода целевого продукта.

Зта цель достигается тем, что способ получения рибонуклеазы осуществляют путем экстрагирования печени рыб кислым водным раствором с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония, обессоливанием и очисткой, в качестве источника сырья используют печень минтая и очистку осуществляют на фосфоцеллюлозе и затем дополнительно рехроматографируют на том же сорбенте.

Пример. 150 r свежемороженной печени минтая мелко измельчают и экстрагируют кислым водным раствором (дистиллированная вода или физи- ологический раствор, подкисленные серной кислотой до рН 2,5-3,0) (1 3 вес./объем) в скоростном электрогомогенизаторе, центрифугируют при

8000 g в течение 30 мин при 4 С. о

Супернатант собирают, операцию повторяют еще раз для полного извлечения .фермента из ткани. К объединенному супернатанту добавляют сульфат аммоо ния 30% насыщения при 20 С перемешивают дб полного растворения соли и о оставляют на 10-12 часов при 4 С для формирования осадка белка, фильтруют через двойной бумажный фильтр при 4 С. Собранный осадок белка растворяют в минимальном объеме 0,05 M аммоний-ацетатного буфера, 0,002 M

ЗДТА, рН 5,3-5,4, обессоливают на колонке сефадекс -25 уравновешен ной этим же буфером со скоростью

220-240 мл/ч.

Обессоленный сырой ферментный препарат адсорбируют на келонке с фосфо13845 2

1О

50 целлюлозои (1,5 45 см), уравновешенной 0,05 M аммоний-ацетатным.буфером

0,002 М ЭДТА, рН 5,3-5,4, промывают колонку этим же буфером до исчезновения УФ-поглощения в элюате при А =

= 280 нм и элюируют фермент 0,01 М фосфатным буфером 0,002 M ЭДТА, рН 7,1. Фракции, содержащие рибонуклеазную активность, объединяют, подкисляют 1Е-ной уксусной кислотой до рН 5,5 и адсорбируют на колонке с фосфоцеллюлозой (объем колонки 2 мл), уравновешенной 0,05 M аммоний-ацетатным буфером, содержащим 0,002 М

ЗДТА, рН 5,5. Конечный целевой продукт элюируют медленной скоростью (6-8 мл/ч), 0,2 М фосфатным буфером, содержащим 0,002 M ЭДТА, рН 7,1. На этом этапе наряду с дополнительной очисткой происходит концентрирование целевого продукта.

Из 150 r печени минтая получают

0,9 мг рибонуклеазы (по белку), выход фермента по активности составляет 43,47., достигнута 278 — кратная очистка фермента.

Исследование рибонуклеазы, получаемой по предлагаемому способу, показало, что: а) оптимум рН 5,5-5,8, о б) температурный оптимум 37 С; в) фермент для проявления активности не требует двухвалентных катионов металлов и ЭДТА, двухвалентные катионы металлов не ингибируют ферментативную активность;

r) рН стабильность: 4,0-8,0; д) лиофильно высушенный препарат стабилен в течение 3-х месяцев при

4 С.

Данные процесса хроматографической очистки кислой рибонуклеазы из печени минтая от стадии получения сырого ферментного препарата до выхода целевого продукта приведены в таблице.

За единицу активности фермента принимали такое количество фермента, ко- торое за 20 мин инкубации при Т

= 37 С приводит к образованию 1 ОЕ спирторастворимых продуктов гидролиза субстрата.

Предложенный способ позволяет увеличить выход рибонуклеазы по активности почти в 2 раза 43,47 по сравнению с выходом фермента, получаемого по известному способу, степень очистки по активности .278,3 раза. Способ непродолжителен во времени, требуется 5-6 дней для получения целевого продукта. Фермент после кислой экстракции из ткани, фракционного высаливания, обессоливания и двухстадийной хрома тографической

Процедура очистки

Степень очистки

Выход фер-. мента по активности, Х

Общая энзиматическая акОбщий белок, мг

Удельная активность, ед/мг белка препарата. по активтивн ость ности

Сырой ферментный

3456

576

2132

61,7

98,8

533

43,4

278,3

1670

1500

0,9

Техред И.Верес Корректор А.Зимокосов

Редактор С.Титова

Заказ 1628/4 Тираж 660 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4 препарат (после фракционирования сульфатом а,ммония ) 1 стадия хроматографической очистки

2 стадия хроматографической очистки

813845 4 очистки на фосфоцеллюлозе является электрофоретически гомогенным и не содержит других примесных ферментативных активностей (ДНКазной, фосфотазной. 4осфодиэстеразной).