Способ диагностики ларвальногоаскаридоза

Способ диагностики ларвальногоаскаридоза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

РЕСПУбЛМК

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (63) Дополнительное к авт. саид-ву— (22) Заявлено 28.05.79 {21) 2771043/28-13 (51}М с присоедииеиием заявки йо—

А 61 В 10/00

Госудврствеииый комитет

СССР ио ямам:. изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 23.0381, Бюллетень N9 11 (53} УДК 616-07 (088.8) Дата опубликования описания 26. 03. 81

Н.В. Чебышев, М.Ш. Вербицкий, М.В. Далин, А.T. Михайлов и О.Г. Полетаева (72) Авторы изобретения

Первый Московский ордена Ленина и орд

Трудового Красного Знамени медицински институт им. И.М.Сеченова на

"{ {1 :(71) Заявитель,4 с

j (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛАРВАЛЬНО О ЫИ w. " у „,...

АСКАРИДОЗА е цО

Изобретение относится к медицине, а именно гельминтологии и предназначено для дйагности ранних стадий аскаридоза.

Известен способ диагностики лаврального аскаридоза с помощью специфической реакции микропреципитации на живых личинках аскарид в возрасте 7 сут.(13.

Однако выход личинок 7 сут. развития от зараженных животных подвержен большим индивидуальным колебаниям,.что затрудняет массовую постановку теста.

Известен также способ ларвального аскаридоза путем проведения реакции между испытуемой сывороткой и сенсибилизированными антигеном эритроцитами с последующим учетом результатов их взаимодействия 52).

Однако известный способ недостаточно специфичен.

Цель изобретения - повышение специфичности.

Поставленная цель достигается тем, что реакцию проводят с эритроцитами сенсибилизированными личиночным антигеном с молекулярным весом 8000-12000 выделенным из полостной жидкости взрослых аскарид и при положительной реакции в титре 160 и выше диагностируют аскаридоз.

Способ осуществляют следующим образом.

Сначала получают специфический личиночный антиген аскарид из полостной жидкости аскариды (ПЖА).

Для этого 120 мл ПЖА фильтруют

0 через милнпоровый фильтр. Фильтрацию ПЖА осуществляют через мембрану с размерами пор 140-145 A.

В ячейку заливают 90,5 мл ПЖА, плотность 0=3,750, рН= 4,95-5,0, 15 выпускают 74 мл диализата 1, 0=4,650, рН=5,0., добавляют 32 мл дистиллированной воды и начинают

1-ю промывку.. V 34 мл; D = 1,360з рН вЂ” 5,05

20 Добавляют 15 мл дистиллированной воды и начинают 2-ю,промывку:

Ч 15 мл, D = 0,860, рН = 5,0, снова добавляют 15 мл воды и начинают 3-ю промывку: Ч 19 мл;

D =. 0,360, рН = 5,2, добавляют

20 мл дистиллированной воды и начинают 5-ю промывку: V 20 мл;

0 = 0,045, рН = 5,0. Диализат 1 и промывки объединяют V = 180 мл

30 0 = 1,530 рН = 5,05.

814339

Диализат стерилизуют через милипоровый фильтр (диалиэат 1).. Концентрат 1, полученный при фильтрации через мембрану с размером пор 140145 A имеет объем 4,5 мл, D = 1,950.

pH =, 5,05. Затем осуществляют фильтрацию диалиэата 1 через мембрану с размером пор 17-18 R. Для этого в маленькую ячейку заливают 180 мл диализата 1. Выпускают 169 мл, 0 = 0,610, рН = 4,0, собирают концентрат П, V = 11 мл, D 14р10 рН = 3,85.

К концентрату П Ч = 11 мл добавляют 22 мл дистиллированной воды и полученный раствор заливают в ячейку мембраны. 1 промывка V = 22 мл, 0 = 0,340, рН=3,9.Добавляют 22 мл дистиллированной воды и начинают .

2-ю промывку, V = 25 мл, D = 0,270, рН = 4,0, собирают концентрат П и промывают.

Проводят повторную коррекцию рН до 5,75-5,9, V = 212 мл, 0 = 0,550, рН = 5,90 (диализат П). Фильтруют через мембрану с размером пор 9-10 A

В большую ячейку заливают 212 мл диализата П. Выпускают 140 мл диализата, 0 = 0,345, рН = 5,05, концентрат с V = 72 мл переносят на маленькую ячейку мембраны с размером пор

9-10 К. Продолжают концентрирование.

Выпускают 65 мл диалиэата, 0

0,470, рН = 5,0. Собирают концентрат ш: V = 7,5 мл, D = 2,850, который стерилизуют через милипоровый фильтр. Доводят. рН концентрата до 7,2-8,6 ° Определяют специфичность антигена в реакциях иммунодиффузии, иммуноэлектрофорезах и РНГЛ.

Личиночный антиген имеет молекулярную массу 8000-12000 при электрофорезе в 0,1 N трис-ЭДТА-боратном буфере мигрирует к аноду со скоростью соответствующей подвижности

Фракции о(,- J5 -глобулинов сыворотки крови человека при градиенте напряжения 5 В/см, в реакции иммунодиффуэии и иммуноэлектрофореза с гипериммунной сывороткой кроликов, зараженных генвазионными яйцами аскариды, формирует полосу преципитации соответствующего протективному специфическому личиночному антигену личинок аскариды 7 сут, развития. Диагностику ларвального аскаридоза с использованием полученного специфического личиночного антигена аскариды осущестьляют следующим образом.

Пример. Консервированные

Формалином эритроциты отмывают три раза забуференным физиологическим раствором, рН 7,2 при 2000 об/мин в течение 3-5 мин.

Состав буфера, мл:

0,15 М NazHP04 72

Ор15 М КН Р04 28

0,9Ъ НаСВ 900

Затем к 2р5Ъ суспензии эритроцитов вливают 1:1 раствор танина в буфере (1:20000 ) и полученную смесь инкубируют в термостате при 37 С в течение 30 мин. .После этого эритроциты отмывают три раза забуференным физилогическим раствором, рН = 7,2 при

2000 об/мин в течение 3-5 мин и ресуспендируют в буфере до 2,5В суспензии.

Меофилизированный порошок специфического личиночного антигена аскариды растворяют в буфере при рН=7,2 до концентрации белка 2 мг/мп.

Танизированные эритроциты соеди15 няют с равным объемом антигена и полученную смесь оставляют в термостате на 3 ч при 370С. Затем эритроциты, сенсибилизированные антигеном (диагностинум) отмывают 3 раза, рещ суспендируют для получения 1,5Ъ суспензии, консервируют мертиолатом (1:10000 конечная концентрация) и оставляют в холодильнике до следующего дня.

Все сыворотки (испытуемые, положительная контрольная сыворотка и нормальная кроличья, на которой ставят реакцию, то есть разводящая) инактивируют, для чего прогревают в водяной бане при 56 С в течение

30 мин. После инактивации сыворотки адсорбируют: к 1 мл сыворотки добавляют 0,2 мл отмытых консервированных эритроцитов и выдерживают не менее

2-х ч, перед постановкой реакции нормальную кроличью сыворотку разводят 1:100 забуференным физиологическим раствором и на ней готовят последовательно двукратные разведения испытуемых сывороток и конт40 рольной положительной, начиная с

1:?0 и кончая 1:1280 (7 разведений).

Реакцию ставят в агглютинационных досках.

Для испытания сыворотки диагностикумом (специфическим очищенным личиночным антигеном аскариды) готовят 2 ряда последовательных дву- кратных разведений (по 0,25 мл в каждой лунке).В первый ряд закапывают диагностикум по 1 капле в каждое разведение сыворотки, à во второй ряд закапывают по 1 капле таниэированных зритроцитов (1:,5 Ъ суспензия - контроль сыворотки) ° В качестве контроля диагностикума прово55 дят аналогичное его испытание с заведомо положительной сывороткой зараженного аскаридами кролика,. взятой на пике актителообразования (20-30 дни развития генвазии), а также с

gp разводящей сывороткой (2-3 лунки).

Реакцию в зависимости от ее интенсивности оценивают по четырехплюсовой системе:

++++ - компактный клеточный агре65 гат, 814339 формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редакто T. Киселева Тех ед A ° Ñàâêà Корректо Г. Наза ова

Заказ 863/3 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Ра сная наб., д. филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

+++ - ровный слой клеток со складчатыми краями на дне лунки, ++ — ровный слой клеток, края местами зазубренные, + — слой клеток окружает темное узкое кольцо, плотный круглый осадок клеток в центре лунки "пуговка".

За положительный результат принимают положительную реакцию не менее чем на три креста с разведением сы воротки 1:160, принятым за диагностический., Предлагаемый способ позволяет повысить специфичность иммунодиагностической реакции на ларвальный аскаридоз и открывает воэможность проведения широких клинических и ветеринарных исследований по выявлению даннсго заболевания.

Способ диагностики ларвального -, аскаридоэа путем проведения реакции между испытуемой сывороткой и сенси билизированнымн антигеном эритроцитами с последующим учетом результатов их взаимодействия, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью

5 повышения специфичности, реакцию проводят с эритроцитами сенсибилизированными личиночным антигеном с молекулярным весом 8000-12000, выделенным из полостной жидкости взрослых аскарид и при положительной реакции в титре 160 и выше диагносцируют аскаридоэ.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Лейкина Е.С. Изучение ин витро 5 антител, вырабатываемых у белых мышей. use lubr.- Медицинская паразитологчя и параэитные болезни", 1947 т. 16, Р 4.

2. Полетаева. О.Г.дЗаточкина Э.Г.

Щ Применение реакции РНГА для определения длительности сезона заражения в очаге аскаридоза.-"Медицинская паразитология.и паразитыые болезни", 1974, Р 3, с. 273-278.