Способ индикации сообщества поч-венных микроорганизмов

Способ индикации сообщества поч-венных микроорганизмов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

tnt 815034

Союз Советских

Соцнаюктнческнх

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ВПЛЬСТВУ (б т) Дополнительное к авт. сеид-ву— (22) Заявлено 280579 (2! ) 2776175/28-13 (5f ) hA Kn.З с присоединением заявки HP—

С 12 К 1/04

Госуявустаеявый коннтет

СССР яе яеавеа язвбретеяяй в втввытяй (23) ПриоритетОпубликовано 2303я1. Бюллетень N9 11

Дата опубликования описания 2 30 3.8 1

Р ) Ю)(576.8.093.

-1(088.8) (72) Авторм изобретения

B.Ñ.Ãóýåâ, Н.Г.Бондаренко, Б.A.Áûýîâ, T.Ã.Ìèð÷èíê и Д.Г.Звягинцев .c.., - - -т ъ.Московский ордена Ленина и ордена Тру одого Красного:- Г

Знамени государственный университет им.;М.В.Ломоносова (71) Заявитель (54). СПОСОБ ИНДИКАЦИИ СООБЩЕСТВА ПОЧВЕННЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к микробио-. логии, а именно микробиологическому анализу почвы при воздействии на нее различными антропогенными факторами.

Известен способ индикации соо6щества почвенных микроорганизмов пу-. тем инкубирования образцов почвы с последующим микробиологическим изучением микроорганизмов. По данному .способу в почву закладывают предметные стекла и оставляют на определенный срок. Поверхность стекол обрастает микроорганизмами,и их микроско» пируют в световом микроскопе. Данный способ позволяет определить:общее количество и биомассу микроорганизмов в почве f1) .

Однако известный способ недостаточно чувствителен, так как не дает 20 информации о микробном сообществе в целом, его структуре, соотношении отдельных групп микроорганизмов,взаимоотношении и взаимодействии мелщу отдельными популяциями микрооргаииз- 25 мов в сообществе, об истинном доминировании тех или иных микроорганизмов °

Цель изобретения — повышение чув- ствительности способа. 30

Поставленная цель достигается тем, что образцы почвы перед инкубированием покрывают слоем крахмала, инкубируют в условиях постоянной температуры и влажности и исследуют выросшие на поверхности крахмала микроорганизмы с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Пример..Исследуемую почву в воздушно-сухом состоянии растирают в ступке, предварительно удалив крупные корешки, просеивают через сито в 1 мм, увлажняют дистиллированной водой до 60В от полной влагоемкости, добавляют, если нужно, изучаемый агент вместе с водой и тщательно перемешивают. Пастообраэную массу вносят в чашки Петри диаметром 4 см и слегка уплотняют шпателем так, чтобы образовалась ровная горизонтальная поверхность. Чашки с почвой помещают в обычно используемые в микробиологии чашки Петри диаметром 10 см.

На дио большой чашки Петри наливают дистиллированную воду для поддержания постоянной влажности. В таком состоянии чашки выдерживают в термо стате при температуре 25 С в течениа всего опыта.

815034

Так как микроорганизмы в почве находятся в рассеянном состоянии, то их инициируют субстратом. Испытание большого числа различных органических субстратов показывает, что наиболее удобным является картофельный водорастворимый крахмал. Так как не существует специфической микрофлоры, разрушающей крахмал, его может ис-пользовать самый широкий набор почвенных микроорганизмов, что видно иэ практики использования в микробиологии крахмало-аммиачного агара.

Кроме того, крахмал нельзя считать чужеродным материалом для почвы, он является основным запасным полисахаридом растений. Особенно велика роль крахмала в почвах агроценозов.

Крахмал наносят через неделю после выдерживания увлажненной почвы в термостате. Наносят на поверхность почвы полоской, шириной около 1 см по диаметру чашки. Производится это следующим образом.

На тонкий слой крахмала осторожно накладывают два чистых листа бумаги, 20 чтобы щель между ними была равна i см,р5 чашку с почвой. переворачивают и аккуратно по диаметру чашки прикладывают на 1 с к образовавшейся полоске.

Затем быстро сдувают лишнее количество крахмала сжатым воздухом, так что- ЗО бы на почве осталась тонкая полоска не более 2-3 слоев крахмальных зерен.

При таком способе нанесения концентрация крахмала составляет около

0,05% о веса почвы.За развитием микроорганизмов на полоске крахмала проводят регулярное наблюдение (визуальное), документируя макросьемкой в масштабе 1:1 на цветную обратимую фотопленку. В дальнейшем зти фотографии позволяют воссоздать последова- 40 тельность раэвития микробного сообщества. Наблюдение за развитием микробного сообщества проводят с помощью светового микроскопа в отраженном свете при увеличениях от 5 до 50 45 крат, фотографируя отдельные участки.

Для детального наблюдения за амилолитическим микробным сообществом используют сканирующий электронный микроскоп. Техника взятия образцов яп сводится к следующему. Из почвы вы" резают цилиндрический монолит.площадью 0,5 см> с тем объектом на поверхности, который необходимо микроскопировать. Монолит наклеивают электропроводящим клеем на объектный столик микроскопа. Образцы фиксируют в парах четырехокиси осмия в течение суток над 2%-ным раствором. Для обезвоживания образцов s большинстве случаев применяют воздушную сушку при 60 комнатной температуре в течение суток. В случае, если микробные клетки сильно деформировались при воздушной сушке, применяют лиофильное высушивание иэ замороженного состояния. 65

Для этого почвенный монолит помещают в жидкий фреон и высушивают при постоянном охлаждении в вакуумном универсальном посте. При микроскопировании чистых культур отдельных микроорганизмов проводят их фиксацию 2,5%ным раствором глютаральдегида в фосфатном буфере (рН=7,2) при 4 .С в течение часа. Затем образцы промывают буфером 30 мин при 4 С. Обезвоживание производят в серии растворов зтанола при 20ф 50%-ный раствор спирта

30 мин, 70%-ный 30 мин, 90%-ный 1 час, 90%-ный 12 ч, 95%-ный 30 мин, 95%ный 30 мин, 100%-ный трижды сменяют спирт через 30 мин. Далее замещают спирт на амилацетат. Высушивание образцов проводят по критической точке, замещая амилацетат жидкой углекислотой на установке НСР-2. Напыление об. раэцов углеродом и золотом проводят в вакуумном испарителе. Толщина напыляемого слоя приблизительно 100 Й.

Просмотр препаратов проводят в сканирующем электронном микроскопе.

Под контролем наблюдения в световом микроскопе проводят выделение отдельных микроорганизмов с полоски крахмала на твердые питательные среды с помощью препаровальной иглы.

Для выделения микромицетов используют агаризованную среду Чапека, для бактерий и актиномицетов — крахмалоаммиачный агар, для дрожжей — суслоагар. В большинстве случаев удается выделять организмы сразу в чистые культуры, так как подавляющая часть микроорганизмов развивается достаточно обособленно.

Для сбора почвенных беспозвоночных применяют традиционный метод воронки. Через фильтр из мельничногогаза нематоды выгоняют водой, а клещи - светом и фиксируют спиртом.

С помощью данного способа оценено микробиологическое состояние 2-ух типов почв при воздействии ряда антропогенных факторов. B дерново-подзолистой почве - влияние различных доз аммиачной формы азотных удобрений— сульфата аммония, в черноземе — .загрязнение почвы различными концентрациями соли свинца (свинцом аэотнокислым).

Предлагаемый способ позволяет выявить различные группы микроорганиэмовчленов инициированного микробного сообщества различных почв. Прокариотные микроорганизмы- бактерии можно встретить в инициированном микробном сообществе, как правило, на поздних стадиях развития, через несколько месяцев. Бактерии часто развиваются на отмерших грибных гифах. Кроме бактерий, хорошо колониэирующих субстрат, можно встретить стебельковые бактерии в рассеянном состоянии. Видовая идентификация бактерий очень сложна и трудоемка. Выявляемые с помощью ска815034

6 нирующего электронного микроскопа морфологические особенности отдельных бактерий позволяют проводить их предварительную групповую идентификацию. Так как эти организмы не являются доминантами в инициированном микробном сообществе, предварительноpro разделения на группы часто вполне достаточно.

Актиномицеты также являются членами амилолитического микробного сообщества, особенно на ранних стадиях его развития. Этн микроорганизмы морфологически характеризуются хорошо развитым и однородным.по толщине мицелием и ярко выраженными спиральными спороносцамн, состоящими из отдельных спор. Эти организма часто развиваются отдельными микроколониями и легкО могут быть вычленены в чистую культуру. Предварительная идентификация возможна .и без выделения в чистую культуру.

Основными деструкторами крахмала являются микроскопические грибы.

Степень покрытия крахмала микромицетами чаще всего приближается к 100%, и они всегда выделяются как доминан- " ты.инициированного микробного .сообщества. Иногие из них не всегда удается выделить на питательные среды, и тогда данные электронно — микроскопического анализа, выявляющие большое количество морфологическнх осо.бенностей данной группы микроорганизмов, являются единственным источником информации для их идентификации.

Представители рода Penicillium хорошо выявляются благодаря своему характерному строению конндиального аппарата. Плодовые тела сумчатых грибов рода Chaetomium имеют на своей поверхности характерные выросты,что облегчает нх предварительную идентификацию. Для выделения сумчатых грибов в чистую культуру необходимо использовать специфические среды, содержащие клетчатку. Пнкнидиальные несовершенные грибы трудно выделить

s чистую культуру, и их идентификация может быть осуществлена на основе мор фологическнх особенностей, выявляемах с помощью электронного микроскопа.

Дрожжевые организмы также могут быть членами инициированного микробного общества, причем они могут занимать значительные пространства и являться доминантами микробного сообщества на более поздних стадиях его развития. В морфологическом отношении дрожжи являются более однородной группой, но по своим размерам они могут сильно варьировать. И даже в. этой группе микроорганизмов сканируюший электронный микроскоп выявляет много морфологических особенностей, к сожалению, недостаточных для их идентификации. В то же время по микрофотографиям можно судить о состоянии дрожжей в данном сообществе .

На более поздних стадиях развития (через несколько месяцев) инициированного микробного сообщества, когда частично уже прошла минерализация крахмала, можно встретить и автотрофные микроорганизма, т.е. диатомовые водоросли класса Centriсае и класса

Pennatae. Особенно много водорослей проявляется при проведении их на свету. Выявляемые на.микрофотографиях морфологические особенности дают ценную информацию для идентификации этих организьюв.

Следующей группой в иницннровант

1з .ном микробном сообществе являются консументы второго порядка-организ:мы,поедающие первичных потребителей крахмала.K этой группе можно отнести разнообразных представителей прос.

20 тейшнх и микроскопических беспозвоночных животных. Видовое разнообразие этой группы обычно невелико.Наблюдения свидетельствуют,что раковинные амебы отряда Testacida и рода Centrppyxis питаются главным образом дрожжами и встречаются только при интенсивном развитии последних. Нема-. тоды нз группы микроскопических коль чатых червей отряда Tylenchidae H микроартроподовые клещи семейства

iAcaridae одинаково хороша питаются как дрожжевыми клетками,так и микроскопическими грибами н актиномнцетами.Причем нематоды избирательно поедают только грибной мицелий,в то время как клещи могут питаться как мицелием грибов,актиномицетов,так и их спорами. Идентификация этой группы проводится на основе морфологнческих особенностей, выявляемых с помощью

40 светового .и электронного микроскопов.

Эти микроорганизмы завершают пирамиду структуры микробного амнлолитического сообщества и встречаются в нем на более поздних этапах, обычно после

4 месяца ннкубации.

Предлагаемай способ позволяет с болььюй степенью достоверности определить всех представителей инициированного микробного сообщества (бактерий, актиномицетов, грибов, водорослей, простейщих, микроскопических беспозвоночных), что нельзя сделать ни одним нз известных способов. Способ позволяет изучить не только структуру, но и особенности инициированного микробиого сообщества, т.е. ис,тинное доминирование, соотнсшение .отдельных групп микроорганизмов, взаимодействие и взаимоотношения между отдельными популяциями микроорганиз4O:ìoâ в сообществе, биологические особенности доминирующих организьюв, скорость и характер роста отдельных

:популяций. микроорганизмов в сообщест ве и их сукцессию. Совокупность этих бя показателей служит критерием для объ815034

Составитель С. Налепив»

Редактор Т. Киселева Техре@ Н. еамтуфа, Корректор Ю. Макаренко

Ю ВЮВ ФФ °

Заказ 962/41 . Тираа 528, Подписное вниипи Госудртвеииого кю иета сссу по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Уаувкркая иаб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. ухгораи, ул. Проектная, 4 ективной и интегральной оценки влияния различных антропогенных загряз- нений на истинное микробиологическое состояние почвы.

Формула изобретения

Способ индикации сообщества почвенных .микроорганизмов путем инкубирования образцов почвы с Посладунвцам микробиологическим исследованием микроорганизмов, о т л и .ч а ю щ и йс я тем, что, с целью новыыения чув ствительности способа, образцы ночвы перед инкубированием покрывают слоем крахмала, инкубируют в условиях постоянной температуры и влахност» и исследуют выросшие на поверхности крахмала ивкроорганизмы с помощью сканирующей электронной микроскопии.

Источники информации, праиятме во внимание при экспертизе

i. Ъабьева И.П., Агре Н.С. Практическое руководство по биологии

fO почв. N. Нзд во МГУ, 1971, с. 22-.

23.