Способ получения деоксинаразино-вого антибиотического комплекса

Способ получения деоксинаразино-вого антибиотического комплекса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(>818492

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (6l ) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 191078 (21) 2676001/30-15 (23) Приоритет (32) 20-10 77

Союз Советских

Социалистических

Республик (51) N- Кл.

С 12 Р 1/06

А 61 К 35/70

С 12 R 1/485

Государственный комитет

Совета Министров СССР но лелам изобретений и открытии (3t) 844087 (33) США (43) Опубликовано 30.038 Бюллетень ph 12 (45) Дата опубликования описания 05.04.81

Щ УЛК 615.779, . 931(088.8) Иностранцы

Вальтер Мицуо Накацукаса, Гари Дж. Марко ти, Йофберт Нойсс и Роберт Л. Хамилл (США)

1 :- (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Эли Лилли энд Компани" (США) (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕОКСИНАРАЗИНОВОГО АНТИБИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к ветерина- рии,- в частности к производству антибиотиков.

Известны способы получения антибиотиков, например А-4696, путем выращивания в аэробных условиях культуры Аесinoplanes sp ATCC 23342 на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли j1) . 10

20-Деоксинаразин и 20-деокси-эпи-17-наразин являются новыми полиэфирными антибиотиками. Они наиболее тесно связаны с известным полиэфирным противомикробным наразином )2) и f3) .

Способ получения деоксинаразиново- ® го антибиотического комплекса заключается в том, что выращивают S t,rep tomyces aureofaci ens NRRZ 11181 в культуральной среде, содержащей усваиваеьые источники углерода, азота и неорганических солей, в условиях аэробной ферментации при погружении и при достижении необходимой величины антибиотической активности, антибиоти,ческий комплекс извлекают из культуральной жидкости в виде кислот и их фармацевтически приемлемых солей.

Деоксинаразиновые антибиотики подавляют рост болезнетворных организмов, патогенных для животных и растений. В соответствии с одним из аспектов изобретения деоксинаразиновые антибиотики являются антикоккидиальными веществами. Кроме того, деоксинаразиновые антибиотики увеличивают усваиваемость пищи жвачными животными °

Деоксинаразиновый антибиотический комплекс включает 20-деоксинаразин и

20-деокси-эпн-17-наразин, получаеьые при брожении в виде смеси. 20-Деоксинаразин и 20-деокси-эпи-17-наразин выделяют и разделяют в виде индивидуальных. веществ в соответствии с приведенным киже описанием. Деоксинаразиновый комплекс также содержит незначительное количество веществ, которые удаляются в соответствии с описанной ниже методикой. Деоксинараэиновый антибиотический комплекс растворим в большинстве органических растворителей, но нерастворим в воде.

818492 разин. Структура 20"деоксинаразина представлена в виде

20«Деоксинаразин обладает той же абсолютной конфигурацией, что и наСНЗ (i) сн

СНЬ СН CHS, Структура 20-деокси-эпи-17-наразина

10 представлена в виде

"С (й) сн, но сн, н

Н

° сн сн сн

Одним из лучших способов дифференциации наразнна (А-28086 фактор A), 20-деоксинаразина и 20-деокси-эпи-17-нараэина является использование С ЯИР-спектрометрии.

В табл. 1 сведены <С ЯИР-спектры 25 этих соединений, каждого в виде жирной кислоты, определенные в дейтерохлороформе (данные в млн. долях).

Таблица 1

Продолжбние та

40

SS другими хорошими методами, позволяющими отличить 20-.деоксинаразин от

20-деокси-эпи-17-наразина и от известных A-28086 соединений, являются

4Q методы бумажной итонкослойной хроматографии. Например,.используя Ва1 сi ilus subtiiis ATCC 6633 в качестве детектирующих организмов, получаются значения и дЛя наразина (A-28086

65 фактор A), A"28086 фактор О, 20-деок»

216,5

178,4

13.2, 0, 122,0

106,5

99,6

88,5

78,4

77,1

75 1

73,8

72,0

70,8

68,5

67,6

56,1

49,9

49,3

41 1

38,7

36,6

216,8

177,9

125,2

121,9

105,0

99,3

88,1

78,1

76,6

75,0

73,7

72,3

71,1

68,3

56,2

49,9

49,3

41,0

40,0

38,8

36 3

218,0

177,6

129,2

125,8

107„0

99,4

85,6

78,2

77,7

77,0

73,3

72,6

71,1

69,1

57,7

49,3

48,7

38,9

36,6

36,4

36,2

35,5

32,9

30,9

30,5

29,4

29,0

28,0

26,1

24,0

21,5

19,0

18,0

16., 4

15,7

14,3

13,2

13,0

12,1

12 1

7,0

6,3

32,8

31,7 .31,7

30,3

29,6

29,0

28,1

25,8

23,7

21,8

18,8

17,5

16 3

15,7

14,1

13,3

13 2

12 5

12,1

7,3

6,5

35,7

33,9

33 7

32,8

30,5

29;3

29,0

28,2

24,7

23,3

21,8

21,1

18 4

18,2

15,8

14,3

13,7 13,5

12,5

12,1

7,7

6;4

818492 синаразина и 24-деокси-эпи-17-нарази- фических

4 на в различных бумажных хроматогра- табл. 2. системах, приведенных в

Таблица 2

Вода: метан: ацетон (12: 3: 1), доведенный до рН 10, 5 ЙН ОН и затем разбавленный до рН

7,5 Н РО>

0,21

0,08

0,11

0,20

Вода:метанол:ацетон i12: 3: 1), доведенный до рН 10 5 NH ОН и затем разбавленный до рН 7,5 НС1

0,25 0,21 0,44

0,42

1% метилизобутилкетон (МИБК), 5% и Н4 ОН в воде

0,38 0,33 0,66

0,56

Бензол, насыщенный водой

Вода:MHSK:ýòèëàöåòàò (98:1:1) 0,55

0,51

0,74

0,51

0,68

0,51

0,61

0,77 кослойной хроматографической (ТСХ) системе, используя силикагель.

В табл. 3 приведены величины R для этих антибиотиков в обычной тонТаблица 3

0,74

0,29 0,35 0,42

Этил ацетат

Деоксинаразиновые антибиотики лизуют получая 417,8 г 20-деокси-эпиj20-деоксинаразин и 20-деокси-эпи-17- -17-наразиновую кислоту. Примерами

-наразин) раствориьы в различных ор- приемлеьых солей щелочных металлов ганических растворителях, таких как и щелочноземельных металлов 20-деокметиловый спирт, этиловый спирт, ди- яп синаразина и 20-деокси-эпи-17-наразиметилформамид, диметилсульфоксид, . на являются соли натрия, калия, лиэтилацетат, хлороформ, ацетон и бен тия, цезия, рубидия, бария, кальция зол, но лишь слегка растворимы в не- и магния. К числу приемлемых аминополярных органических растворителях, солей 20-деоксинаразина и 20-деоккак например гексан, и совсем нера- си-эпи-17-наразина относятся соли створимы в воде. Следует однако иметь а>тония,,первичные, вторичные и трев виду, что 20-деоксинараэиновая сво- тичные С1 -С алкиламмониевые и окси бодная кислота нестабильна в спиртах, С -С4 -алкиламмониевые соли . К числу так как превращается в 20-деокси-эпи- аминосолей относя ся те, которые

-17-нараэиновую свободную кислотУi получают реакцией 20-деоксинаразина

Например, 435,1 мг 20-деоксинаразино- 40 и 20-деокси-эпи-17-наразина с гидровой кислоты растворяют в 40 wt мети- окисью аммония, метиламином,вторич- лового спирта и выдерживают при ком- ным бутиламииом, изопропиламином, наткой температуре 4 ч. Затем раст.- диэтиламином, диизопропиламином, тривор выпаривают досуха в вакууме, ос" этиламином, 3-амино-1-пропанолом и таток растворяют в диоксане и лиофи- Я подобными соединениями.

818492

Для выращивания 5 t ге p tomy ce s

aur ео f ac l en s NRRZ 11181 предпочтительным углеводным источником является тапиоковый декстрин, хотя также могут применяться глюкоза, кукуруза, крахмал, плодовый сахар, манноза, солодовый сахар, молочный сахар и подобные соединения. Другими источниками углерода могут служить кукурузное масло, масло земляного ореха, масло соевых бобов и рыбий жир. Предпочтительным источником азота является фермент гидролизуемого каэеина, хотя также могут применяться пептоны, мука соевых бобов, мука иэ семян хлоп5 чатника, аминокислоты, такие как глутаминовая кислота и т. и. К числу пи" тательных неорганических солей, которые могут быть включены s культуральную среду, относятся обычные ра створимые соли, способные образовыО вать ионы натрия, магния, кальция, ам" мония, а также хлоридный, карбонатный сульфатный, нитратный и тому подобные ионы. В состав культуральной среды должны также быть включены микроэле" менты, необходимые для роста и развития организмов.

При осуществлении процесса брожения в крупных масштабах может оказаться необходимым добавлять небольшие количества (0,2 мл/л) противопенного агента, такого как полипропиленгликоль, если вспенивание представляет серьезную проблему. Выход антибиоти1ка увеличивается при добавлении малых количеств масла, такого как масло аоевых бобов.

Для получения значительных количеств деоксинараэиновых антибиотиков предпочтительно осуществлять глубинную аэробную ферментацию в ферментерах. Меньшие количества этих антибиотиков могут быть приготовлены во встряхиваемой колбе. Поскольку временная задержка при производстве антибиотиков обычно связана с инокуляцией больших ферментеров споровыми формами организмов, желательно применять растительную посевную культуру. Растительный инокулят готовят засеванием: малого объема культуральной среды споровыми формами мицелиальных фрагментов организма с целью получения свежей активно растущей культуры организма. Затем растительный посевной материал переводят в большие ча» ны. В качестве культуральной среды для выращивания растительного инокулума может использоваться та же среда, что применяется,при более крупномасштабном брожении, но могут использоваться также и другие среды.

Деоксинаразин-выделяющий организм может расти в пределах от примерно

20 до 40 С. Оптимальный температурный диапазон получения деоксинараэинов ограничен значениями примерно от

27 до 30ОС. Через среду продувают стеКатионные соли щелочных и щелочноземельных металлов 20-деоксинараэина и 20-деокси-эпи-17-нараэина получают в соответствии с методикой, обычно используемой для приготовления катионных солей. Например, антибиотик в виде свободной кислоты растворяют в подходящем растворителе, таком как ацетон или водный диоксан. К этому раствору добавляют другои раствор, содержащий стехиометрическое количество требуемого неорганического основания. Полученную в результате соль выделяют обычными способами, такими как фильтрование или выпаривание растворителя.

Аналогичным способом могут быть приготовлены соли органических аминов. Например, к раствору антибиотика в приемлемом растворителе, таком как ацетон, может быть добавлен газообразный или жидкий амин и затем испарением удаляется растворитель и избыток амина.

Предпочтительной методикой получения требуемой соли одного из деоксинаразинового антибиотика является соответствующий начальный выбор процедуры выделения, например регулирование рН бульона добавлением соответствующего основания или добавлением к экстрагирующему растворителю соответствующей катионной соли.

При лечении животного форма антибиотика не имеет значения. В большинстве случаев под влиянием условий, существующих внутри организма животного, происходит изменение первоначальной формы лекарства. Следовательно,для методики лечения не имее, значения, что лекарство вводится в солевой,форме. Однако солевой форме может отдаваться предпочтение, исходя из со 40 ображений экономики, удобства и токсичности. Новые антибиотики .получают культивированием штамма Streptomyces

aureofac!ens производящего деоксинаразин, при глубоких аэробных условиях 4 в подходящей культуральной среде до тех пор, пока не будет получена существенная антибиотическая активность.

Антибиотики извлекаются с помощью различных методов выделения и очистки, обычно применяемых и известных в технике.

Организм, используемый для получения деоксинараэиновых антибиотиков получается путем мутации Streptomyces

aureofaciens,NRRZ 8092 (3) под действием N-метил-N — нитро-N-нитрозогуанадина. Культура, применимая для получения деоксинаразиновых антибиотиков, сдается на хранение и входит в коллекцию чистых культур Северного ф) регионального исследовательского центра Министерства сельского хозяйства

США, сельскохозяйственной исследовательской службы в. Пеории, штате Иллинойс 61604 под номером ййВЕ 11181. 45

818492

10 рильный воздух Эффективный рост организма достигается тогда, когда в ферментер подают примерно 0,1 объема воздуха на объем культуральнои среды в минуту. Для эф(ективного получения антибиотиков объем подаваемого воздуха при производстве в ферментере должен быть больше 0,25 объема культу-. ральной среды в минуту. Высокие концентрации растворенного кислорода не подавляют образования антибиоти.ков.

За получением антибиотиков необходимо следить по ходу процесса брожения, отбирая пробы бульона или "-xczрактов твердых грибниц для определения антибиотической активности. Для испытания предлагаемых антибиотиков применяется организм Васi11us subti1is ATCC 6633. Биоанализ удобно проводить с помощью дисковых бумажных проб на агаровых средах. Начальный 20 рН незасеянной культуральной среды меняется в зависимости от применяемой среды. Обычно рН должен быть в пределах от 6,0 до 7,5 рН в конце брожения обычно несколько выше, в пределах 6,5-8,0. Обычно антибиотическая активность обнаруживается на второй день ферментации. Максимум антибиотической активности обычно достигается примерно на 4-10-й день.

При полученйи деоксинаразиновых антибиотиков глубинным аэробным брожением они могут быть извлечены из ферментативной среды способами, обыч- З но используегыми в технологии брожения. Получаемые при брожении антибиотики присутствуют как в мицелиальной массе, так и в отфильтрованном бульоне. Максимальное извлечение деоксинаразиновых антибиотиков достигается, 40 следовательно, совместным осуществлением таких способов. как фильтрование, экстракция и адсорбционная хроматография. В качестве растворителя для выделения деоксинаразиновых антибио- 45 тиков либо изб всего, либо из фильтровального. ферментативного бульона предпочтительно использовать этиловый эфир уксусной кислоты, хотя удовлет- . ворительные. результаты получают при применении других, обычно используемых растворителей .Особенно предпочтительным способом выделения деоксинаразиновых антибиотиков является понижение рН всего ферментативного бульона примерно до

3,0. При этой величине рН деоксинаразиновые антибиотики удобно отделять с .мицелиальной массой, используя метод фильтрования. Другим выгодным моментом этого способа является добав- 40 ление бикарбоната, такого как бикарбонат натрия, ко всему бульону в количестве примерно 1 г/л. Используя данный способ, деоксинаразиновые антибиотики удобно отделять от мицели- 65 альной массы в виде соли. Для отделения антибиотиков от мицелиальной массы предпочтительно испольэовать в качестве растворителя метиловый спирт, однако также могут применять ся и другие низшие спирты и кетоны.

Для извлечения деокоинаразиновых антибиотиков может с успехом использоваться также азеотропная перегонка.

В соответствии с этим способом ор-. ганический растворитель, который образует cooTBетствующую азеотропную смесь с водой, добавляют к водному ферглентативному бульону. Полученную смесь растворителя и бульона подвергают азеотропной перегонке для того, чтобы удалить, по крайней мере, половину воды из бульона и получить смесь воды с растворителем, в которой в органическом растворителе растворены деоксинаразиновые антибиотики. Нерастворимяе побочные продукты могут быть отделены соответствующими способами, такими как фильтрование или центрифугирование. Затем деоксанаразиновые антибиотики извлекаются из органического растворителя, используя хорошо известные методы, такие .как выпаривание растворителя, осаждение добавлением нерастворителя или экстракция.

В качестве примеров органических растворителей, образующих азеотропные смеси с водой для осуществления такой процедуры извлечения, могут быть указаны такие соединения, как бутиловый, амиловый, гексиловый и бензиловый спирты, бутиловый эфир уксусной кислоты, амиловый эфир уксусной кислоты, 1,2-дихлорэтан, 3-пентанон, 2-гексанон, бензол, цнклогексанон, толуол, ксилол .и подобные соединения.

При осуществлении процессов брожения в крупных масштабах извлечение особо предпочтительно проводить методом азеотропной перегонки. Вода и растворитель, отогнанные из азеотропной смеси, могут быть разделены из -вестными методами и затем рециркулироваться для повторного применения. Отделенная таким способом вода не содержит загрязнителей и не требует осуществления процесса обработки сточных вод. Дополнительная очистка деоксинаразинових антибиотиков включает дополнительную экстракцию и адсорбцию. В качестве адсорбента предпочтительно применять такие материалы, как силикагель, уголь,флоризил и подобные материалы. С другой стороны, возможно применен: е твердой культуральиой массы, содержащей компоненты среды и мицелий, без осуществления. экстракции или разделения в качестве источника деоксинараэинового анти"биотического комплекса, но желательно после удаления воды. Например, после достижения деоксинаразиновой антиби818492

Т а б л и ц а 5

Actinomyces

Clostridium

israeli i w 855 8

perf riRgens 81 16

septicum 1128 16

Сlostridium

Таблица,4 4

Staphylococcus

aureus 3055

3074

3130

13,8

15,4

17,2

16,9

19,5

19,0

Таблица 6

10,0

14,6 Щ

И. gallisepticum

И. hyorhlnts

Н. synoviae

25 0

50,0

50,0

13,0 е5 отической активности культуральная среда может сушиться путем лиофилизации или на вальцовой сушилке и прямо добавляться к питательной смеси.

В.соответствии с другим аспектом изобретения после достижения активности культуральной среды отделяют мнцелий и сушат его, получая продукт, который может непосредственно использоваться в качестве пищевой добавки. При отделении мицелия для такого применения добавки карбоната кальция (примерно 10 г/л) облегчает фильтрование и дает высушенный продукт более высокого качества.

20-Деоксинаразин и 20-деокси-эпи-, -17-нараэин разделяют и выделяют в виде индивидуальных соединений, приьеняя хорошо известные методы, такие как хроматография на колонках, тонкослойная хроматография, противоточное э() распределение и подобные способы.

Например, для разделения .20-деоксинараэина н 20-деоксн-эпи-17-наразина применяется хроматография на колонке с силикагелем с использованием для элюирования колонки различных смесей растворителей. Применяя смесь иэ таких растворителей, как бензол и этиловый эфир уксусной кислоты, в колонку с силикагелем сначала элюируют

20-деокси-эпи-17-наразин, а затем . ЗО

20-деоксинаразин. Тонкослойная хрома« тография на колонке с силикагелем с применением чистого этилового эфира уксусной кислоты является удобным способом для контроля за процессом З5 элюирования..

Деоксинараэииовые антибиотики- являются противомикробными агентами.

В табл. 4 представлена относительная микробиологическая активность 4Q

20-деокси-эпи-17-наразиíà (свободной кислоты) при применении стандартного диско-диффузионного метода.

Streptococcus pyogenes (группа А) 12,0 (группа О) 17,0

Diplococcus pneumonia 16,0

" Устойчивые к пенициллину.

Устойчивые к метициллину.

В соответствии с одним из.аспектов изобретения деоксинаразнновые антибиотики подавляют рост анаэробных бактерий.

В табл. 5 представлены минимальные подавляющие концентрации (MOK) 20-деокси-эпи-17-наразина (свободной кис« лоты) относительно различных анаэробных бактерий. МПК определены стандартным анализом разбавления агара. Конечные значения соответствуют 24-х ч инкубационному периоду.

Eubacterium aегоfaciens 1235 16

Peptococcus asaccharogiticus 1302- &

Peptococcus prevail 1281 4

Peptos t reptococcus anae rob i us 1428 4

Pep tos t reptococcus i n te reedi us 1264 4

Propionibacterium acnes 79 2

Весящего!4ез f ragi gis 111 128

Активность против микоплазмя является другим ценным аспектом актимикробной активности деоксинараэиновых антибиотиков. Вид микоплазьк иэвестнь1й как пяевро-легочкоподобный (ПЛПО) организм, является также болезнетворным для человека и различных животных. Вещества, активные про-. тив ПЛТО организмов, особенно необходимы в птицеводстве.

В табл. 6 сведены значения минимальных подавляющих концентраций (ИПК) 20-деокси-эпи-17-наразина (свободкой кислоты) против укаэанных видов микоплазмя, определенных. in

vitro на бульокных разбавлениях.

818492

Таблица 7

3 араже нные к онт рол ьные

20-Деоксинаразин (100 млн. до- 0 лей) 37,5 114

4,00

0,13

185

1 дне клети с четырьмя курами в каждой.. для обработки.

Максимально возможное число, равное 4,00

Деоксинаразиновые антибиотики являются также противовирусными препаратами. Например, 20-деокси-эпи-17-наразин активен против риновирусного типа 3, вакцилногоi вируса, герпе.свируса и вируса ннфлюенца А.

В соответствии с одним иэ аспектов изобретения деоксинарзиновый антибиотик может вводиться млекопнтающим перорально, местно или парентерально для подавления вирусов. Для профилак- о тики илч лечения вирусных заболеваний применяются обычно дозы, которые меняются примерно от 1 до 5 мг/кг тела млекопитающего в зависимости от типа вируса и от того, применяется ли ле» карство профилактически или терапевтически. Более того, растворы, содер- жащие деоксинаразнновый антибиотик, предпочтительно вместе с поверхностно-активным веществом могут применяться для дезактивации in ч1tro мест 2О обитания, где присутствуют вирусы, такие как полно или герпес. Для поданления вирусов эффективны растворы, содержащие примерно 1-1500 мкг/мп деоксинаразинового антибиотика. Острая токсичность 20-деокси-эпи-17-наразииа

Для профилактики или лечения кокцидиоза домашним птицам предпочтительно ежедневно перорально вводят эффективйое количество деоксинаразинового О антибиотика. Деоксинаразнновый антибиотик может быть в различных формах, но .наиболее удобно использовать его . вместе с физиологически приемлемыми носителями, предпочтительно с пищей, заглатываемой птицами. Хотя следует учитывать различные факторы при определении подходящей, концентрации деоксннаразинового антибиотика, вводимое количество обычно находится в пределах 0,003-0,03% от веса нелечеб- 4ф ного корма и предпочтительно в пределах 0,004-0,02%.

Изобретение относится также к антикокцидиальным.пищевым композициям для домашней птицы, включающим корм Я (свободной кислоты) и 20-деоксинаразина (натриевой соли) при внутривенноМ введении мышам,. выражаемая в виде LDgo равна 201 мг/кг и 5 мг/кг соответственно.

Антнкокцидиальная активность является важным свойством деоксинаразиновых .антибиотиков; 20-Део синаразин (соль натрия) и 20-7 еокси-эпи-17-наразин (в виде свободной кислоты) являются активными и соединениями в количествах уже 0,2 частей на тысячу, против Еimeriа tenelle, простейшего организма, большей частью ассоциирующего с кокцидиозом.

Опыты на молодых цыплятах показывают, что деоксинараэиновые антибиотики обладают антикокцидиальной активностью in vivo. 20-Деоксинаразин (натриевая соль), вводивший в количестве 100 млн. долей в пищу цыплят, зараженных Е1вег1а tene11e, предотвращает смертность, улучшает прирост и уменьшает число поражений у цыплят. результаты эксперимента представлены в табл. 7. для домашней птицы и примерно 35 - .

180 r деоксинараэинового антибиотика на тонн у.

Способность улучшить эффективность усваивания пищи животными является другим важным свойством жеоксинараэи новых антибиотиков. Например, указанные антибиотики улучшают усваиваемость пищи жвачными животными, которые обладают, развитой функцией рубца.

Деоксинаразиновые антибиотики обычно эффективно увеличивают выход пропионатов.и, следовательно, улучшают усзаиваемость пищи при введении жвачным животным перорально, в количестве примерно 0,05-5,0 мг/кг в день.

Наиболее впечатляющие ревультатыдостигаются при введении антибиотиков в количестве примерно 0,1-2,5 мг/кг в..

818492

1б день. Предпочтительным способом введения антибиотиков является их смешение с кормом для животного. Однако возможно и иное их введение, например в форме таблеток, киселей, пилюль, или капсул. Составление этих различных дозированных форм может осуществляться способами, хорошо известными в ветеринарном фармацевтическом производстве. Каждая индивидуальная дозированная единица должна содержать такое количество соединения, которое непосредственно связано с подходящей суточной дозой для больного животного.

Изобретение относится также к пищевым композициям, предназначенным для откармливаемых пород жвачных животных, таких как крупный рогатый скот и овцы. Эти пищевые композиции включают корм для крупного рогатого скота и 1-30 г деоксинаразинового ан- 20 тибиотика на тонну корма.

Дизентерия у свиней является обычным заболеванием в GrlA и других странах, ежегодно вызывакщая повсеместный падеж скота на свиноводческих фер- 5 мах. Профилактику и лечение дизентерии у свиней предпочтительно осуществлять включением эффективного количества деоксинаразинового антибиотика в пищевой рацион. Деоксинаразинбвые антибиотики обычно эффективны для предотвращения или лечения дизентерии у свиней, если они вводятся свиньям перорально в количестве примерно 35150 г активного соединения на тонну корма. Особенно предпочтительным количеством является примерно 100 r активного соединения на тонну. наиболее приемлемым способом введения антибиотиков животным является добавка препарата в корм скоту, хотя он мо- 40 жет вводиться также иными способами, например в виде таблеток, капсул, киселей или пилюль. Каждая дозированная единица должна содержать такое количество антибиотика, которое непо- 45 средственно связано с требуемой суточной дозой для животного, подвергаемого лечению.

Изобретение касается также пищевых композиций для свиней, включающих рацион для свиньи и эффективное количество деоксинаразинового антибиотика.

Как указывалось ранее, эффективное количество антибиотика обычно нахо) ится в пределах примерно 35-150 г деоксинаразинового антибиотика на тонну корма. Деоксинаразиновые антибиотики являются противовирусными препаратами и активны против анаэробных бактерий, таких как Сlostrid!um Щ

perfringens. Следовательно, деоксинаразиновые антибиотики целесообразно использовать для лечения и профилактики воспаления тонких кишок у кур, свиней, крупного рогатого скота 6$ и овец, а также при лечении воспаления брюшины у жвачных животных.

Некоторйе деоксинаразиновые соединения (20-деоксинаразин и его соли) проявляют ионосвязывакщие и ионотранспортирующие свойства и, следовательно, являются ионоформами. Эти соеди-. нения могут применяться в том случае, когда желательно осуществить селективное удаление определенного катиона.

Примерами такого применения являются удаление и извлечение ионов серебра из фотографических растворов, удаление токсичных катионов из промышленных сточных вод перед тем, как такие воды попадают в окружающую среду, и обессоливание морской воды. Деоксинаразиновое соединение может использоваться в качестве одного йз компонентов ионоспецифического электрода.

Эти соединения изменяют катионную проницаемость природных и искусственных мембран. Следовательно, деоксинаразиновое соединение может применяться в качестве компонента мембраны, используемой для селективного перемещения катионов.. против градиента концентраций. Одним из возможных применений этогб свойства является извлечение тяжелых и благородных металлов в промышленных масштабах.

20-Деоксинаразин и его соли являются также активными ингибиторами энзима ATC аза, АТФ-аза-фермент, чувствительный к щелочным металлам, был найден в клеточных мембранах. Он вовлечен в энергетические расходы для "активного транспорта". Под "активным транспортом" подра=.„„мевается ряд процессов с затратой энергии, с помощью которых поддерживается состав внутриклеточных и экстрацеллюлярных жидкостей. Ингибиторы АТФ-азы. уменьшают энергию, требуемую для активного транспорта. В опытах вне организма (in vitro) показано, что 20-деоксинаразин: (натриевая соль) подавляет катионтранспортирукщую

АТФ-азу в печеночной митохондрии при половинной эффективной концентрации

0,065 мгк/мп.

20-Деоксинаразин и его соли яв-ляются также эффективными препаратами, тонизирующими деятельность сердца. В экспериментах на изолированном предсердии морской. свинки 20-деоксинаразин, например, увеличивает сокращение сердца. Следовательно, изобретение включает также способ увеличения усилия сокращения сердечной мышцы теплокровного млекопитающего, в соответствии с которым вводится эффективная нетоксичная доза 20-деоксинаразина или доза фармацевтически приемлемой его соли. Эффективная нетоксичная доза находится в пределах примерно 30-500 мкг/кг живого веса.

Предпочтительный диапа"-рн доз ограничен значениями примерно 30—

18

818492

100 мкг/кг жив го веса. Для рассматриваемого способа антибиотик вводится парентерально, например внутривенно. Приемлемым способом введения является капельный метод, при котором антибиотик включают в стандартный внутривенный раствор, такой как раствор глюкозы.

20-Деоксинаразин предпочтительно вводят в дозах ниже примерно

100 мкг/кг до тех пор, пока не на. блюдается требуемое усилие силы сокращения. Затем количество вводимого 20-деоксинаразина может регулироваться скоростью подачи так, чтобы обеспечить требуемую реакцию. Как и в случае клинического применения дру- 1з гих инотропных препаратов, доза 20†.деоксинаразина может меняться для данного клинического случая в зависимости от таких факторов как индивидуальная, восприимчивость к 2Б-деокси- 2О наразину, характера сердечных нарушений, т. е. степени повреждения сердечной мышцы, возраста и общего физического состояния больного.

Предлагаемый способ получения антибиотического комплекса, включающий применение положительного инотропного агента 20-деоксинаразина, может использоваться в ряде клинических ситуаций, широко классифицируемых как З1 кардиогенный шок. К ним относятся, например, инфаркт миокарда, послеоперационный кардиогенный шок и прогрессирующая сердечная недостаточность.

Пример 1. A. Ферментация во встряхиваемой колбе.

Готовят культуру 5treptomyces

au reofaciens N RRZ 11181 и сохраняют ее на скошенном агаре, имеющем следующий состав, r: к,нро„

2 40

М950ц 7Н О О, 25

М Н„ЫОь 2

СаСО 2,5

Fе50а ° 7Н О О, 001

МпС1 7Н О О, ОО1 4

ZnS0I, ° 7Н 0 О,001

Глюкоза 10

Агар 20

Деиониэированная вода До 1 л рН (нерегулируемое) 7,7

Скошенный агар засевают Streptoвусеа aureo fac i ens NRRZ 11181 и зараженный скошенный агар инкубируют при ЗО C до 7 дней. Созревшую культуру IioKpblIsaIOT CTepHJrbHOH rOBHRьей сывороткой и стерильной петлей удаляют

cIIopM Полученную говяжьесывороточную суспензию спор и мицелиальных фраг ментов лиофилизируют в максимум шести гранулах.

Одна гранула, приготовленная та- 60 ким образом, применяется для инокуляции 50 мл растительной среды следующего состава,. r:.

Глюкоза 20 .Соевая мука 15 65

2,5

Жидкость после замочки кукурузы 10 мл

Са СОз

Водопроводная вода До 1л рН регулируют до 6,5 добавлением

5 н. гидроокиси натрия.

Зараженную растительную среду в эйрленмейеровской колбе объемом

250 мл инкубируют при 30оС приблизительно 24-28 ч на качалке со скоростью вращения 250 об./мин. Инкубированную растительную среду, приготовленную в соответствии с.описанием (50 мл), используют для инокуляции

250 мл одной из ферментативных сред.

Среда 1 имеет следующий состав, r.:

Тапиоковый декстрин" 60

Энзимом гидролиэованны к аз еи н б

Ферментативный гидролиэат казеина ?

СаСОь 2

NgS0„7Н О 0,5

Меласса йортвейна с патокой 15

Очищенное соевое масло 0Ä5 мл/л

Водопроводная вода До1л рН (нерегулируемый) 6,6 Стадекс 11, A. E. Стели, г. Де1атур штата Иллинойс.

Амбер ЕНС, Лабораторий Амбера, г. Джуни штата Висконтин.

Амин A фиржи Шефилд Кемикл г. Норидж штата Нью-йорк.

Среда 2 имеет следующий состав, r:

Тапиоковый декстрин" 30

Глюкоза (15

Энэимом гидролиэованный казеин 3

Ферментативный гидролизат казеина ОЙ(Дрожжевой экстракт .Ca Соз

М95О„ 7Н„О

Меласса портвейна с патокой 15

Очи@енное соевое масло 5,0 мл/л

Водопроводная вода До1л рН (нерегулируемое) 6,4 н, xx, xxx Соответствуют значениям, указанным в примечании к среде 1.

Среда 3 имеет следующий состав, г:

Соевая мука 25

Глюкоза 20

СаСОь 2,0

Na>S0< ° 10Нд О 1 0

Очйщенное соевое масло 20 мл

Метилолеат 20 мл

FeS0» 7Нао 0,6

МпСI . iIHg0 0,3

Аскорбиновая кислота 0,018

Деионизированная вода До 1 л рН (нерегулируемое) 6,5

Брожение проводят 10 дней при

30оС на качалке со скоростью вращения

250 об./мин.

Б. Брожение в ферментере.

818492

Таб

100%

Бензол

Бензол-этилацетат

3,0 л

2,0 л

9: 1

4: 1

То же

600 мл

300 мл

300 мл

То же

18.

22

22

900 мл

2,0 л

300 мп

450 мп

450 мл

11

12

13

1,2 л

1,2 л

14 28 100

70 .

12

1,0 л

1,0 л

Я е

То же

1,5 л

1,5 л

16

17

18

450 мл

900 мл

1,0 л

300 мл

100В

Этилацетат

Используя растительную и фермента.тивную среду, описанную в разделе А для брожения в колбе на качалке, проводят ферментацию в ферментере..

Для ферментации в ферментере берут

10 мл растительной среды и осуществляют вторую стадию инокуляции 400 мл растительной среды в 2 л эйрденмейеровской колбы. После инкубирования

24 ч при 30оС 800 мл растительной среды со второй стадии используют для высевания в 100 л,ферментативной среды, находящейся в 165 л ферментера. рН среды после осуществления стерилизации при 121 С 45 мин равно примерно 6,8+О, 1. Брожение продолжается 10 дней при 30+10C. Чан продувают стерильным воздухом с расходом

0,5 объемов воздуха на объем культуральной среды в минуту, осуществляя перемешивание стандартными мешалками со скоростьЮ 300 об./мин.

Пример 2. Отделение деоксинаразинового комплекса. рН всего ферментативного бульона (4 л), приготовленного способом, описанным в примере 1, с использованием среды 2 понижают добавлением концентрированной соляной кислотМ, перемешивая в течение часа. Полученный раствор фильтруют через слой мелкозернистого материала i 125 r диатомной земли марки Гуфло Супер-Сел фирма

"Джонс-Иенвилл"). Отфильтрованный мицелий экстрагируют отдельными порциями с применением мешалки. Экст5 рагирование осуществляют всего 2 л метилового спирта, в котором содержится 50 r йаНСО на 1 л. Иетанольный фильтрат упаривают в вакууме до объема примерно 450 мл. рН этого раствора регулируют до 7,5 добавлением концентрированной соляной кислоты. Полученный раствор дважды экстрагируют хлороформом (500 мп). Хлороформовые экстракты объединяют, сушат над сульфатом натрия и фильтруют.

1S Фильтрат упаривают в вакууме, получая

2,0 r сырого деоксинараэинового комплекса.

П р и и е р 3. Разделение деоксинаразина и эпи-деоксинаразина.

Щ 2 г сырого деоксунаразинового комплекса, приготовленного в соответствии с примером 2, растворяют в небольшом количестве бензола и пропускают через колонку с силикагелем (Мерк 7729) длиной 22 см и диаметром

1 5 см.

Выделенные фракции, применяемые растворители и количественные выходы указаны в табл. 8.

21

818492

125.

150 мл

150 мл

450 мл

300 мл

450 мл

Этилацетат

То же

То же

170

Метанол

То же

24

1100 ° над сульфатом натрия, фильтильтрата досуха в вакууме.

Полученный после сушки рования и упаривания ф

Фракции контролируют методом тонкослойной хроматографии с использованием в качестве растворителя этилацетат. Фракции 16-17 (126 мг) содержат 20-деокси-эпи-17-наразин, а фракции 18-23 - смесь 20-деоксинаразина 20 и 20-деокси-эпи-17-нараэина.

Смесь 20-деоксинаразина и 20-деокси-эпи-17-наразина, присутствующую в фракциях 18-23, подвергают хроматографическому разделению по методу 25 препаративной тонкослойной хроматографии. В качестве растворителя используют этиловый эфир уксусной кислоты. Смесь (105 мг на одной пластине и 130 мг на другой) растворяют в малом количестве дихлорметана и вносят на силикагельный (клерк) препаративный лист. После проявления листа два раздельных материала наблюдают в ультрафиолетовом свете. Каждую из областей, занятую двумя веществами, удаляют с листа и экстрагируют смесью дихлорметана и метилового спирта (4:1). В этой системе деоксинаразин представляет собой более медленно движущийся компонент по сравнению с 40 двумя другиьы . Из листа, содержащего

105 мг материала, выделяют 7,5 мг

20-деокси-эпи-17-нараэина и 27 мг диоксинаразина. С листа, содержащего

130 мг смеси, получают 4,0 мг 20-деок- 5 си-эпн-17-нараэина и 56 мг 20-деоксинаразина.

Пример 4. Другой способ выделения 2Р-деоксинаразина.

Весь ферментативный бульон (95 мл) у) регулируют до рН 3 добавлением соляной кислоты с последующим перемешиванием в течение часа. Добавляют филь1тровый мелкозернистый порошок (марки !

Гуфло-Супер-Сел, 3%) после чего филь груют бульон. Отделенную мицелиальную фильтровую лепешку дважды экстрагируют примерно 45 мл ацетона, который содержит 50 г бикарбоната натрия в литре. Ьцетоновые экстракты