Способ очистки микробной трипсино-подобной протеиназы

Способ очистки микробной трипсино-подобной протеиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (i ц 819167

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 05.07.78 (21) 2668896/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 07.04.81. Бюллетень № 13 (45) Дата опубликования описания 07.04.81 (51) М. Кл.

С 12D 13/10

Государственный комитет

СССР ло делам изобретений и открытий (53) УДК 678 021 83 (088.8) (72) Авторы изобретения

Л. С. Лагутина и И. С. Петрова

jt

Ордена Ленина институт биохимии им. А. Н. Бахa (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ МИКРОБНОЙ

ТРИПСИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ

Изобретение относится к способам производства ферментных препаратов микробного происхождения, в частности к получению заменителеи животного трипсина.

Известен способ очистки микробной трипсиноподоонои протеиназы (1), полученнои из культуральной жидкости путем осаждения сульфатом аммония нри Ob насыщения и фракционного осаждения ацетоном, который включает следующие ста- 1р дии.

Ионообменная хроматография этого препарата на КМ-целлюлозе в О,оМ фосфатном буфере рН 6,0. Для вымывания оелков из колонки была применена ступенчатая элю- 15 ция следующими концентрациями NaC1 в исходном буфере: 0,03М; 0,06М и 0,1М.

1 ельфильтрация на сефадексе Г-7b фракции IV, полученной при хроматографии на

КМ-целлюлозе, которая обладала высокой трипсиновой активностью, с целью дальнейшей очистки. Полученныи фермент обладает рН-стабильностью в интервале рН от 4,0 до 9,0 и сохраняет лишь 9% активности при 10-минутном нагревании до

60 С,.

Таким образом известный способ не позволяет получить фермент, обладающий достаточной термостаоильностью и устойчивостью при низких значениях рН. 30

Целью изобретения является расширение сырьевой базы и получение фермента, обладающего повышенной термостабильностью и стабильностью в кислои среде.

11оставленная цель достигается тем, что в известном способе очистки микрооной трипсиноподобной протеиназы в качестве микрооной протеиназы используют прото<ррадин, осуществляют хроматографирование ее на ДЭЛЭ-целлюлозе и после гельфильтрации на акрилексе повторно хроматогра<рируют на КМ-целлюлозе и сефадексе.

Сущность способа заключается в следующем.

Для очистки целевого фермента предусматривается проведение следующих стадий: фильтрование через ДЭАЭ-целлюлозу для очистки протофрадина от балластных белков и пигментов; гельфильтрация на акрилексе П-10 протофрадина, очищенного на ДЭАЭ-целлюлозе, для отделения большей части сопутствующих протеаз; хроматография на КМ-целлюлозе частично очищенной на предыдущих стадиях трипсиноподобной протеиназы для отделения примеси АТЭЭ-эстеразы с применением для вымывания белков линейного градиента

NaC1;

819167

Формула изобретения

Составитель О. Ленчицкая

Техред И. Заболотнова

Редактор Е. Хорина

Корректор Л. Слепая

Заказ 726/20 Изд. № 258 Тираж 581 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 0К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 ббессоливание целевого продукта на колонке с сефадексом Г-15.

1 омогенность полученной протеиназы доказана методами ультрацентрифугирования, электрофореза, изоэлектрического фокусирования и гельфильтрации.

Полученный предлагаемым способом фермент стабилен в области рН 2,0 — 10,0, причем в интервале рН 2,0 — 4,0 сохраняется 100% активности. При прогревании фермента при 60 С в течение 10 мин сохраняется 19% активности фермента.

Пример 1. 7 r лиофильно высушенного протофрадина растворяли в минимальном количестве воды и наносили на колон- Гб ку (5Х60 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную 0,015М фосфатным буфером рН

8,0. Колонку промывали тем же буфером.

Элюат собирали, осаждали 3,5 объемами этанола, растворяли в воде и лиофильно высушивали.

Лиофильно высушенный белок наносили на колонку (3,7Х80 см) с акрилексом

П-10, уравновешенную 0,05М фосфатным буфером рН 6,0. Скорость элюции 20 мл/ч, объем фракции по 10 мл. Фракции, обладающие наибольшей трипсиновой активностью, объединяли и непосредственно наносили на колонку (1,7Х18 см) с КМ-целлюлозой К-32, уравновешенную тем же буфе- 30 ром, который применялся для гельфильтрации на акрилексе П-10. Скорость элюции

12 мл/ч, объем фракции 6 мл. Для вымывания белков из колонки применяли линейный градиент NaCi в исходном буфере 35 с концентрацией соли 0 — 0,2М в объеме

600 мл.

Фракции, соответствующие пику трипсиноподобной протеиназы, объединили и проводили их обессоливание на колонке 40 (1,7Х20 см) с сефадексом Г-15. Скорость элюции 12 мл/ч, объем фракции 3 мл.

Определение эстеразной активности фермента. В ходе очистки активность трипсиноподобной протеиназы определяют коло- 45 риметрическим методом с использованием в качестве субстрата N-n-тозил-1.-аргинин-. метилового эфира (ТАМЭ).

К 0,2 мл 0,02о М раствора 1 ЛМЭ в 0,1М трис-буфере рН 8,6 приливают 0,1 мл исследуемого раствора фермента. Проводят инкубацию в водяной бане при 37"С в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением 0,3 мл 2М раствора гидроксиламина и 0,3 мл 3,5н. раствора NaOH. Пробу выдерживают 25 мин при комнатной температуре. Добавляют 5 мл 0,11М раствора хлорного железа и тщательно перемешивают. B пробах развивается оранжево-красная окраска, которую измеряют через 10 †мин против пробы на реактивы (0,3 мл трис-буфера+0,3 мл раствора гидроксиламина+0,3 мл раствора NaOH+

+5 мл хлорного железа).

Контроль на ТАМЭ: 0,2 мл 0,025М раствора l AÌÝ+0,1 мл трис-буфера рН 8,6, инкубация в течение 10 мин и далее, как при определении активности.

Предлагаемый способ позволяет выделять трипсиноподобную протеиназу из отечественного штамма актиномицета, а также получать фермент, обладающий повышенной термо- и кислотостабильностью:

Способ очистки микробной трипсиноподобной протеиназы с помощью хроматографии и гельфильтрации, о тл и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью расширения сырьевой базы и получения фермента, обладающего повышенной терм оста бильностью и стабильностью в кислой среде, в качестве микробной протеиназы используют протофрадин, осуществляют хроматографирование ее на ДЭАЭ-целлюлозе и после гельфильтрации на акрилексе повторно хроматографируют на КМ-целлюлозе и сефадексе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Biochem. Bioplcus, Acta, 139, 382, 1967.