Способ определения активностиглюкозо-1-фосфатазы /k.ф.3.1.3.10/ b сперме

Способ определения активностиглюкозо-1-фосфатазы /k.ф.3.1.3.10/ b сперме

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1ц 819! УО

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Ооеетских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт, свид-ву (22) Заявлено 19.06.78 (21) 2647765/30-15 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 07.04.81. Бюллетень № 13 (45) Дата опубликования описания 07.04.81 (51) М. К .

С 12(} 1/42

Государственный комитет

СССР

ilo делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15.08 (088.8) (72) Автор изобретения

Ю. Г. Курило (71) Заявитель Полтавский научно-исследовательский институт свиноводства (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ГЛЮКОЗО-1-ФОСФАТАЗЫ (К. Ф. 3.1.3.10) В СПЕРМЕ

Способ относится к методам исследования, а именно определению активности ферментов в биологических тканях.

В доступной нам литературе мы не встречали описания методики определения ак- 5 товности глюкозо-1-фосфатазы в биологических тканях.

Для определения активности глюкозо-6фосфатазы в гомогенате печени и в сыворотке крови существует метод В. С. Аса- )o тиани, который основывается на количестве отщепившегося фосфата от глюкозо-6-фосфата (1).

К инкубационной среде, состоящей из

0,5 мл веронал-ацетатного буфера рН 6,5, вносят 0,2 мл сыворотки кровки и 0,3 мл

0,01 М раствора глюкозо-6-фосфата, смесь инкубируют при 37 С в течение часа. Конечный объем реакционной смеси 1 мл.

После инкубации и осаждения белков в трихлоруксусном фильтрате определяют неорганический фосфат по методу Фиске-Суббороу.

Определение активности глюкозо-6-фос- фатазы этим методом недостаточно точный, 25 так как здесь имеет место наслоение действия неспецифических фосфатаз и он не подходит для определения активности глюкозо-1-фосфатазы.

Целью изобретения является повышение точности определения активности глюкозо1-фосфатазы.

Для достижения указанной цели перед введением пробы спермы в реакционную смесь вносят фтористый натрий и арсенат натрия при следующем соотношении компонентов, мкг/мл:

Фтористый натрий 139,97 — 279,93

Арсенат натрия 34,67 — 69,33

Пример. Предложенный способ осуществляется следующим образом.

К инкубационной среде, состоящей из раствора трис-HCI-буфера рН 7,6 0,05 М— ! мл, калиевой соли глюкоза-1-фосфата

0,06 M — 0,5 мл, фтористого натрия 0,1 М—

0,15 мл, арсената натрия 0,005 М вЂ” 0,1 мл, добавляли исследуемый материал 0,5 мл, инкубировали в водяной бане при 37,5 С в течение разных промежутков времени от

15 мин до 4 час, но более закономерно проявляется активность при 60-минутной инкубации (табл. 1). Реакционная смесь соответствует 2,25 мл. Реакцию прекращали внесением в пробы 2,25 мл 10% трихлоруксусной кислоты. В контрольной пробе трихлоруксусную кислоту добавляли перед внесением исследуемого материала. Через

81917() 3

30 мин пробы фильтровали. Влияние концентраций арсената натрия и фтор истого натрия на активность неспецифических фосфотаз показано в табл. 2.

Таблица 1

Активность фосфатаэы глюкозо — 1-фосфата (к. ф. 3. 1. .3.;10) в свежей и храненной сперме хряка мл отщепившегося фосфата на 100 мл спермы:

Переживаемость, оо время инкубации в минутах 37,5 С

Хранение в часах

180

120

240

30

78,70 3,85

73 08 2 98

74,88д2,56

54,66 2,27

75,00 1,43

69,50 1,26

63,17 2,81

49,32 1,34

87,70 3,55

77,60 3,20

79,67+ 3,07

57,44 2,96

24,20 1,86

19,25 + 0,85

21,63 1,39

9,20 0,14

71,90 1,83

71,60 1,78

62,07 1,44

37,56 1,59

39,90 3,22

36,40 2,53

36,53+ 2,13

14,00 1,67

61,90 3,01

63,00 3,31

50,40 2,50

29,76 1,56

Свежая

24

48

84

79

73

Цифровые данные обработаны статистически по методу М, А. Ойвина (1960)

Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1960, 1чъ 4, с. 76 — 85

P=0,95 (P<0 01) 1000 у, 0,6190 х — 0.212 2,920 мг

К 2 мл трихлоруксусного фильтрата добавляют 2 мл молибденового реактива, смешивают в соотношении 1: 1 5О/о-ный раствор молибденовокислого аммония

) NH< ) аМотО д-4НаО) с 5%-ным ра створом серной кислоты (Н 804). В качестве восстановителя вносили 1 мл насыщенного раствора тиомочевины (HgCSNHg), растворяют 9 г тиомочевины в 100 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирок хо-. рошо смешивали и ставили в водяную баню на 10 мин при 38 С. После охлаждения до комнатной температуры пробы калориметрировали на ФЭКМ при 590 — 610 ммк (красный светофильтр). Одновременно ставили слепую пробу, где вместо фильтрата брали дистиллированную воду и стандартную пробу с известной концентрацией фосфора. Для приготовления стандартного раствора фосфора брали навеску калия фосфорнокислого однозамещенного (КН2РО4)

0,4394 г и растворяли в 1 л дистиллированной воды, в однолитровой мерной колбе.

1 мл раствора содержит 0,1 мг или 100 мкг (микрограмм) фосфора. После по пропорции высчитываем концентрацию фосфора в

1 мл фильтрата, которое умножаем на 4,5 з. и получаем количество РО 4.

Например, в 1 мл исследуемого материала выявлено 0,6190 мг неорганического фосфата, концентрация спермиев в 1 мл, подсчитанных при помощи камеры Горяева 0,212 миллиарда. Высчитываем по пропорции активность на 109 спермиев.

0,212 — 0,6190

10 1000 — х

Если учесть, что 1 спермий хряка имеет

15 125 кубических микрона и полученное количество отщепившегося неорганического фосфата в микрограммах разделить на 125, тогда получим активность, выраженную в микрограммах, неорганического фосфата на

20 2920 мг мм массы спермиев =23 36 мкгlмм

Если учесть, что микромоль глюкозо-1фосфата соответствует 31 микрограмму неорганического фосфата, тогда мы делим

25 23,26 мгк

3I

= 0,753 мкм/моль на мм массы спермиев. Кроме того, полученные данные в 1 мл исследуемого материала умножаем на 100 и получаем активность на 100 мл

30 спермы.

СЧ ь

СЧ

GO

С0

С|

CD

4О

С| (О о

CD

Ю

ОЪ

С|

С:1 4»

1Q

С| ръ

С|

СЧ

»:|

CD

СО л

1Q

Й

D, v

C)

Ю с4»

СЧ

СЧ (»0

С>

4СЮ ,м х ч (Q

64 °

Ф Сб и

64 х

CD

»6»

С|

С| л

С5

С>

Ф о

СО

ОЪ

0О

Ю

CD

CD

CD

СЧ

»6»

ОЪ

Ю

0О

0О

0О о о

GO (» л

С1

Р Э л с4»

С|

1Q (Э (О

С|

СЧ

РЭ

0О о

СЧ

0О

C)

СЧ . с4»

ОЪ

С| (:|

СО

СО

CD ь л

С| с(» (О

С 4

1Q

С| (О

Й а и

ot/л

С>

С|

1Q

С 4

С>

С>

С>

»Ф

С> 4» (О

0О

Ch

1О л о (» о

1Q

СЧ

0О

СЧ

Cb о

|.О о

СО

C(4

»6» о

»(4»

»6»

|О о

СЧ (О

CD о

Ю

|О

CD

1О х о х о и р: и

0С|, |О л х

II x

| х

3»6

М 6»

\Q

»:>

З

О» и о (х

"И л

СЧ

|О (О о.„"

Ю СО ох

»6 х

» |

СО 6» о

Ю

Ю

СО

»(» о

»4»

»:> л

C)

CD

CD

CD о

Щ

СО

С|

CD

СЧ (О

001/» л

С|

GO

Щ

С|

GO

С|

С> (О

С|

СЧ

С|

CD о

СЧ (О (О о

СО (О

1О

С|

1Q (1О

С:|

)О

С5

3О (О

С|

CD

СЧ и а

1О

С(»

С| (O

СС»

СЧ

О4 ((|

С>

C(4

С| л

С| т3»

Ю л

С|

С| р4 л

Ю

CD (»

С|

0О с4

8

oot/

С0

CD

С|

С 4

СЧ

С|

Ф

С|

Ю (Ю

Ф Ф хх а (6 ах х »6

Р о х хх

Х о

Ю

СЧ х ч

O (6 х у5 х («

6» (6

Ч 46» оч

Х О

Ф,Я» х °

4» ° »

go

6> О хх х Я (d о

D» Х4 .4

Х IO

|Р Ч(О хо х (»

Х 64(Е ххэ хх: к х х о, Рх 64 (d 64 +

ХХ64

O

8» х х dl хрхх И хнах

О» О» Cd («и|р

65 Ъ

Ифх

4 64

cd а

Cd х ч ах

Ф »« о хх .64 р хь оо х я»

»х ч о о (б а 64

64 О

С6

d» 8 хо хо

CCI 6

IrN OOt/» нанизана ,ии/ляи нанимаю

01/aw

IrN 001/ли лч oot/» нанимаю сии/нли

IrN 00I/ли

Irw 00t/ли нанизана сии/лни нанизана

ot/»

aN 00t/ли нанимаю ,ии/ля и нанизана

0 /

Irw/ dIrN H

aaIINdaIIO винейлнанно ли н W,IIir

- н. иаЮ ноякдх @(х

6 v

Х 64

М 3

С(» л»р

0О (. х

II Й

»6

З, 44 (»

«х о И

gR

Я СО ох о х х (о

Х 64

И М

CD ".

»6 |С>

|О Х

»» ф И (О (» х

"й (»Э

"ОЪ

До

СЧ ох о х х

G4 и и

|О

D4 з

«х х

С»|

II И и с. х

1.О о, л СО

Ю о х х о (» 64 х ф

1Q |О>

0С»„, р»х

СЧ Х (С)

II 6

» и

tQ

И о(О

Cb ." Р4 . СЧ ох х

В х о, о (6

Ф х х а (» (6 (6 ах (О хо

gÎ Ov

В хо

64

М

О о

1О

II x

»6 Х

М и о (» (О 4 (8 СС

8х ох х о

С 64 х и

g v

cr» |О (О ъ

II x х

Д

И о

«х м;. и

1Q Я о лоох х х

64

g v

CD»D

1О ъ х

II x

6 Х и к

И

-( ох

„И Я

8о»

8f9170

1О Cb

СЧ CD

СО (O

»С» СО

РЪ CD с(» CD о

Cr»

CD (O

»3»

СЧ Я о (О GO с1 л

GO (ф о о

0С| |О

СЧ СЧ

СО

|О

00 \О

819170

Формула изобретения

Составитель А. Макаров

Корректор Л. Слепая

Редактор Л. Курасова

Техред И. Заболотнова

Заказ 642/17 Изд. № 258 Тираж 530 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5.

Типография, пр. Сапунова, 2

Способ определения активности глюкозо-1-фосфатазы (к. ф. 3.1.3.10) в сперме, преимущественно хряков, включающий введение пробы спермы в реакционную смесь, содержащую трис-НС1-буфер, калиевую соль глюкозо-1-фосфата с последующим инкубированием, добавлением раствора трихлоруксусной кислоты для прекращения реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения активности, перед введением пробы спермы в реакционную смесь вносят фтористый натрий и арсенат натрия при следующем

5 соотношении Компонентов, мкг/мл:

Фтористый натрий 139,97 — 279,93

Арсенат натрия 34,67 — 69,33

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

10 1. Асатиани В. С. Ферментные методы анализа, 1969, с. 503 — 507 (прототип).