Способ определения лизосомолабили-зирующего действия веществ
Патент 819171
Авторы
Классы МПК
Способ определения лизосомолабили-зирующего действия веществ
Иллюстрации
Реферат
О П И C А Н И Е ()))819171
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 04.01.79 (21) 2706693/28-13 с присоединением заявки № (51) М. Кл з
С 12Q 1/44 (43) Опубликовано 07.04.81. Бюллетень № 13 (45) Дата опубликования описания 07.04.81 (53) УДК 615.51 (088.8)
/ по делам изобретений и открытий
И. М. Буйкис и А. В. Спринговичс /
Латвийский научно-исследовательский институтэкспериментальной и клинической медицины (72) Автор изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ЛИЗОСОМОЛАБИЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ
Государственный комитет (23) Приоритет
Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии.
Известен способ определения лизосомолабилизирующего действия веществ путем введения их животным с последующим исследованием гидролаз в печени (1).
Однако известный способ недостаточно точен и длителен.
Целью изобретения является повышение точности способа и ускорение его. 10
Эта цель достигается тем, что исследуют распределение хлорацетатэстеразы и появлении ее в перибиллиарных зонах определяют лизосомолабилизирующее действие веществ. 15
Способ осуществляют следующим образом. Подбирают молодых, однотипных, здоровых животных, так как любое инфекционное или паразитарное заболевание может спровоцировать неспецифическую активацию лизосомного аппарата клеток, предшествующую некробиотическим изменениям в гепатоцитах.
Испытуемые вещества (например, твин-60, тритон BP 1339, тритон х-100 и т. д.) опытным животным вводят парэнтерально. Дозы выбирают в зависимости от токсических свойств препарата и ожидаемого лизосомолабилизирующего эффекта, обычно в интервале концентраций 10 — М, З0
10 — з М, в пересчете на живой вес животных (при использовании низ ком олекулярных соединений), Через 24 — 48 ч опытных животных (в группе по три животных) под легким эфирным наркозом обезглавливают, извлекают печень и кусочки последней размером
1Х1 см замораживают в жидком азоте или в криостате.
Криостатные срезы изготавливают при — 15 С, толщиной 15 — 20 мкм. Срезы расправляют на предметных стеклах и подсушивают при комнатной температуре 15—
30 мин.
Криостатные срезы печени фиксируют в парах формалина при комнатной температуре в течение 15 мин.
Проводят гистохимическую реакцию на хлорацетатэстеразу. Данная реакция наиболее четко показывает лабилизацию лизосомной мембраны, что выражается в четком увеличении активности фермента в перибилиарных областях гепатоцитов.
Состав инкубационной среды: 20 мг нафтол А — Д вЂ” хлорацетат растворяют в 1 мл диметилформамида, добавляют 25 — 30 мл фосфорного буфера рН 5,5 мл и 20 мг прочного синего ББ.
Если в срезах имеются ферменты хлорацетатэстеразы (эластаза и др.), то суб819171
Составитель С. Малютина
Техред И. Заболотнова
Редактор Т. Зубкова
Корректор Л. Слепая
Заказ 642/18 Изд. № 258 Тираж 530 Подписное
НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Типография, пр. Сапунова, 2 страт нафтол А — Д вЂ” хлорацетат расщепляется, и нафтол А — Д вЂ”, связываясь с краской — прочный синий ББ, дает синюю зернистость.
Продолжительность инкубации при температуре 37 С в термостате в течение 30—
90 мин.
Препараты заключают в глицерин-желатину и изучают на световом микроскопе. В участках лабилизации лизосомного аппа- 10 рата обильно отлагаются синие гранулы, преимущественно в перибилиарных областях гепатоцитов.
Степень лабилизации лизосомного аппарата в перибилиарных областях гепатоци- 15 тов оценивают полуколичественно по следующим четырем ступеням:
1 — в перибиллиарных областях гепатоцитов активность хлорацетатэстеразы не обнаруживается или слабая положительная реакция на данный фермент выявляется до
5% гепатоцитов. Такая картина обнаруживается в нормальной печени и при отсутствии лизосомотропного эффекта у испытуемого вещества; 25
2 — четкое увеличение активности хлорацетатэстеразы в перибилиарных областях обнаруживается до 25 — 30% гепатоцитов;
3 — четкое увеличение активности хлорацетатэстеразы в перибилиарных областях гепатоцитов обнаруживается у 50 — 60% гепатоцитов;
4 — высокая активность хлорацетатэстеразы в перибилиарных областях обнаружи4 вается более чем у 50-60% гепатоцитов, По данной шкале полуколичественно может быть оценен лизосомотропный эффект любого испытуемого вещества в зависимости от его дозы, способа введения, сроков действия и т. д.
Предлагаемый способ обеспечивает быстрое определение, ответ может быть получен уже в течение 1 — 2 ч после убоя животных, обеспечивает высокую точность и позволяет в короткие сроки обследовать большое количество веществ на предполагаемый лизосомолабилизирующий эффект.
Способ позволяет в физиологических условиях провести отбор малотоксичных и высокоактивных лизосомолабилизирующих веществ, способных модифицировать функции лизосомного аппарата клеток в норме и патологии.
Формула изобретения
Способ определения лизосомолабилизирующего действия веществ путем введения их животным с последующим исследованием гидролаз в печени, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью повышения точности способа и ускорения его, исследуют распределение хлорацетатэстеразы и при появлении ее перибиллиарных зонах определяют лизосомолабилизирующее действие веществ.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Покровский А. А. и Тутельян В. А, Лизосомы. М., 1976, с. 226 — 243.