Модифицированная 4-

Модифицированная 4-

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Белорусский научно-исследовательский институт неврологии, нейрохирургии и физиотерапии . (71) Заявитель (54 ) МОДИФИЦИРОВАННАЯ 4-(4-АМИНОА НИЛИНО) -5-МЕТОКСИ-1,2-БЕНЗОХИНОНОМ СЕФАРОЗА В КАЧЕСТВЕ АФФИННОГО

ХРОМ АТОГРА ФИЧ ЕСКОГО СОРБЕНТА МЕ НАДИОНРЕДУКТАЗЫ (КФ 1.6.99.2) 1

Изобретение относится к биологии .,,и медицине, в частности к эксперименталь ной и аналитической биохимии, в частности к новому химическому соединению» модифицированной 4-(4-А мино-анилино)5

5-метокси-1,2-бензохиноном сефарозе.

Данное соединение проявляет свойства, позволяющие использовать его в качестве аффинного хроматографического сор15ента менадионредуктазы НАД(Ф) Н: акцептор оксидоредуктазы (КФ1.6.99.2) и может быть применено для быстрого .:: выделения или очистки данного фермента, а также для изучения свойств фермента в условиях гетерсфазной системы, Известен ряд соединений на основе производных агарозы (сефарозы), которые используются s качестве аффинных хроматографических сорбентов для выделения и очистки различных ферментов.

Известен ряд соединений общей фор-, мулы

2 где p - остаток сефарозы, Д (СН ) Сн - — (Сй ) С,Н,— Сьн

0=а- о

1 которые получают посредством конденсации алифатических или ароматических аминов с В СМ-активированной сефаразой

4В, применяемых в качестве аффинных сорбентов гликозидаз (2).

С пако, вышеуказанные соединения используются в качестве аффинных сорбентов для выделения ферментов лищь определенного класса и не могут быть использованы как аффинные хроматографнческие сорбенты менадионредуктазы °

Аффинные хроматографические сорбенты для выделения и очистки менадионредуктазы в литературе не описаны.

Цель изобретения - расширение ассортимента аффа ных хроматографических сорбентов для выделения и очистки ферментов, получение аффинного сорбента ме. надионредуктазы, специфически связывающего этот фермент, и обеспечивающего таким образом возможность быстрого получения

3 82 очищенного фермента с высоким выходом иэ исходных неочищенных препаратов.

Поставленная цель достигается свойствами модифицированной 4-(4-аминоанилино) -5- метоксне.l,2-6ензохиноном сефароэы общей формулы где Р - остаток сефарозы.

На фиг. 1 представлена схема синтеза. модифицированной 4-(4- аминоанилино)5-метокси-1,2-6ензохиноном сефароэы, на фиг. 2 — .аффинная хроматография менадионредуктаэы, на фиг. 3 - анализ методом диск-электрофореэа в полиакри ламидном геле препаратов менадионре дуктаэы опыта, показанного на ф!я; 26.:.

Опыть! (см. фиг. 1 и 2) выполнены на колонке с объемом сорбента 2,6 мл при

201"С, скорость прохождения растворов через колонку 0,3-0,4 мл/мин. Пунктир-: ной линией показан белок и сплошной— содержание менадионредуктазы»

А. Сорбент (М). 1 — неочищенный препарат менадионредуктазы, 2,2 мг белка с удельной активностью

4,2 мкмольУ(мин мг), 1,15 М фосфатный буфер,рН 7,5 с 0,5 М NyC9; 2-1/15М фосфатный буфер, рН 6,0,"0,5 ММС6;

3-12 мМ НАДФН,; 1/15 М фосфатный буфер, рН 6,0; 0,5 MNaCR 4-10 мМ

НАДФН; 1/15 М фосфатный буфер, рН

6,0; 0,5 МКаС6.

Б.Сорбент (М ).1 - неочищенный препарат менадионредуктазы, 17,8 мг . белка с удельной активностью

1,2 мкмоль/(мин мг); 1,15 M фосфатный буфер, H 7,5; 0,6 Мйа(Х; 2-10 мМ

НАДФН, 1/15 М фосфатный буфер рН 6,9; 0,6 М%!С8.

А и Б - неочищенный исходный препарат менадионредуктазы (см. фиг. 3);

В и à — препарат после хроматографии на сорбенте (Й!! ), М - положение менадионредуктаэы.

Предлагаемое соединение получают на основе СК — активированной сефаро. зы 4 В и активированной СН - сефарозы

4В mb) путем нижеуказанных превращений (см. фиг. 1), где соединения (1} и (V) цредставляют соответственно

СКВ - активированную сефарозу 4В и активированную CH — сефарозу 4В, а вертикальная черт а обозначает полимерHv!o матрицу сефарозы.

- Как вытекает из схемы, синтез нового соединения проводят в несколько этапов. Реакции присоединения первичного амина к активированной сефарозе

5 проводят известным способом (11, получение анилино-производных 4,5-диметокси-1,2-бензохинона (реакции (2) и (4)) также осуществляют известным путем Г4), Модифицированные 4-(4-аминоани1О лино)-5-метокси-1,2-бензохиноном сефарозы несут ковалентйо связанную струк" туру 4-анилино-5-метокси-1,2-6енэохинона, который является субстратом менадионредуктазы. Этот хинон специфи15 чески взаимодействует с менадионредуктазой с образованием фермент-суб . страктного комплекса, что обеспе чивает высокую селективность извлече» . ния фермента из смеси белков. Балласт2р ные белки не!сорбируются на этом сорбенте и выходят из хроматографической колонки. Таким образом, модифицированная, сефароэа представляет собой аффинный сорбент менадионредуктазы, приме2S нение которого позволяет выделить менадионредуктаэу изсмеси белков и обеспечить высокий выход фермента.

Н р и м е р 1. Модификация СМВ активированной сефарозы 4В. а) 3 r CHB< -активированной сефарозы

4В подвергают набуханию в 1 мМ НСР, Суспензию промывают 600 мл 1 мМ НС1 и 50 мл 0,1 М боратного буфера, рН 8,0, содержащего 0,5 ММпСР на стеклянном фильтре под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом. Сефарозу переносят в колбу, содержащую 20 мл 0,13 М !-фенилендиамина, растворенного в борами

4О ном буфере. Суспензию выдерживают

45 мин в условиях осторожного перемещения при 23оС>после чего переносят на фильтр и промывают 600 мл Н О4600 мл

0,5 М раствора МСО в боратном буфере,pH8,0.

Промытая.сефароза имеет белый цвет с легким синеватым оттенком.

6) К обработанной сефарозе добавляют

21 мл 18 мМ 4,5-диметокси-1,2-бензо, хинона,j приготовленного на боратном

S0 буфере (0,1 М, рН 8,0). Суспензию выдерживают при помешивании 1ч40 мин, после чего промывают 500 мл воды, 50 мл боратного буфера и 150 мл фосфатного буфера 0,07 М, рН 7,5, содержащего а растворе 0,5 МйцС9. Промытый продукт в массе обладает краснофиолетовой окраской, у которого в электронном спектре обнаруживается типичный максимум аминохинона при 510 нм. В присут5 825543, 6 ствии восстановителей, (тетраборгидрида Сорбент, приготовленный, как описан. натрия и др.) максимум исчезает. Про- выше, упаковывают в колонку высотой дукт при добавлении восстановителей около 2,4 см. На колонку наносят в обесцвечивается. После отмывки восст объеме 0,5-1 мл исходный раствор, неновителя при .::стоянии на воздухе про очищенного фермента-менадионредуктадукт восстанавливает свою краснофио- зы, (остальные условия хроматографии- .5 летовую окраску и максимум в видимой см. фиг. 2).области спектра. Все эти свойства при- Элюат, т.е. раствор, прошедший через сущи автооксидабельным дифенолам и их колонку, собирают фракциями в объеме амиыохинону, что полностьюсоответствует 1-2 мл, как это показано на гистограмsa указанному в описании результату моди мах фиг. 2. Во всех фракциях определяют фикации. белок и испытывают на активность менаПродукт модификации сефарозы, полу- дионредуктазы. Результаты изложены в ченный .по (а) и (б). обеспечивается пояснении к фиг. 2 и 3 и таблице. также в присутствии менадионредук- 15

Как видно из эксперимента, связыватазы и НАДН (восстановленного никоти вне менадионредуктазы с сорбентом намидаденнуклеотида) . Последний не .вос высоко специфично. Балластные белки станавливает аминохиноны в отсутствие появляются вслед за свободным объемом менадионредуктазы. Таким образом, колойки. Менадионредуктаза остается на,бр ванне аминохинона ук„ывает СВЯзанной с СОРбентом ее элю РУ . zo также высокоспецифическая ферментативная добавлением другого субстрата - ЦАДФН.

:, - реакция. Таким образом, модифицированные родификация активированной СН .. сефарозы Уд рживают менадионредуктазу, фарозы 4В. но не связывают другие примеси. Наа) 2,2 r акт в ован ой СН ф р 25,пример, в опыте, показанном на фиг. 2

4В подвергаю набух и,мывке..- . до введения НАДФН. выз ающего ca

A как было описано выше для СЙВ -акти- цифическую десорбцию менадионр онредуктавированной сефарозы 4В. зы, через колонку объемом 2»6 мл было

Сефарозу встряхивают на протя енин пропущено 50 мл Разных Растворов. По1 ч при ?5 С с 15 мл Q,Qg (раствора о

h-фенилендиамина в боратном буфере, РН и вь соким содержанием NOCO. При

РН 8,0 П е этого производят мьщку т ой o6pa6mKe кц вымывают все получившегося продукта 400 мл Н О белки, не обладающие способностью аф.и 50 мл боратного буфера. Огмытый финного связывания с сорбентом. продукт имеет белый цвет с легким

З5

На фиг. 3 приведен пример электросиневатым оттенком. форетического анализа исходного, нео6) Q продукту, полученному по и. а чищенного пРепаРЬта менационРедУктазы добавляют 11 мл 18 мЯ раствора 4,5- и фермента после хроматографии на соР диметокси-1,2-6ензохинона в боратном бенте (п ). Как видно из этого пРибуфере, РН 8,0. Суспензию встряхивают 40 меРа, пРоисходит одномоментнаЯ очистка о

1 ч 30 мин при 25 С, после чего от- - фермента из сложной смеси белков до мывают на стеклянном фильтре 5QQ мл двУх белковых фРакций. Аналогичные

Н О. К продукту добавляют 0,05 ф трис- результаты получены для сорбента (И ). буфер, РН 8,0 и выдерживают при В таблице даны количественные встряхивании 2 ч. Производят отмывку 4 Результаты хРо м ато графин менад ионр едукпродукта дистиллированной водой, 400 мл. тазы, из котоРых видно, что фермент

Получившийся продукт обладает красно- повышает свою активность в 102 Раза фиолетовой окраской. Его спектральные + выход ego cooT eT 83 характеристики идентичны таковым для Приведенные выше примеры в совопродукта модификации С В вЂ” активированнойв << >»араКТ pm3y T высокУю сорбционсефарозы 4В. Продукт о есйвечивается .. ю, специфичность модифицироВанных при восстановлении, в том числе и при 4(4 аминоанилино) 5 MeTozcm-l,2специфическом ферментативном восста- бензохиноном сефароз и доказывают новлении, как было описано выше. Окрас- аффиннУю приРодУ свЯзываниЯ менадионка восстанавливается до исходной при 55 Редукт ы с этими сорбентами. ПРиместоянии на воздухе. некие и редлагаемых выше модифицированиых сорбентов обеспечивает быстрое, одно.

Пример 2. Аффинная хроматогра- этапное получение очищенного фермента фия менадионредуктазы. с высоким его выходом.

82 5543

Количественная оценка аффинной хроматографии менадионредуктазы на сорбенте (Фп ) (Данные эксперимента фиг. 2б) Определения активности выполнены с „ 4% при 6-8 наблюдениях одержание рмента, % ная Кратно м марио сло, м фермента ность очистки ь/ мг) Исходный препарат ме надионредуктазы

1l,91

1,3

22680 100

Препарат после аффин ной хроматографии

102 18900

0,03 132,9 формула изобретения

Модифицированная 4-(4-аминоанилино)-5-метокси 1,2-4эензохиноном сефароза общей формулы нсо о

/ 8 О ь где В - остаток сефарозы, в качестве аффинного хроматографического сорбента менадионредуктазы „ (КФ.1.6.99.2).

Источники информации принятые во внимание при экспертизе

4.

1. Безвершенко И. А. Аффинная хроматография. Киев, "Наукова думка, 1978, 14-27.

2. Авторское свидетельство СССР № 660975, кл. С 07 G 7/02, 1977.

3. А 1 пйЬ СЪг01паЬо(р арйу. РФ; пс р ев апа Ме иоая -"РИаггаМа Г г в Cqe30 1Са09 > ЯФМеИ, Я74>9-10, М-Ú2..

4. Мпх Исус Н.-%., Jabnte О. Sasen ММа8>cherie Mcohol?adala on an n зло 1 2АзпоМе О-C&none,-"Cherniecbe Ser с ЬЫ, 101,- 968, 374 Ф - Ы53..

825543 сь

Р

ИИ

\ц

ВНИИПИ Закаэ 2577/84

Тираж 530 Подписное филиал ППП "Патент», r.Óæãîðîä,óë.Ïðîåêòíàÿ, 4