Патент ссср 825626

Патент ссср 825626

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскик

Социалистическик

Республик

Gll ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<и 825626

>>

- 1 ф »- = (6! ) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 05.04.79 (2! ) 2746557/28-13 (51) М. Кл.

С 12 К 1/00

С 12 D 13/06 с присоединением заявки №

Гооударотееииый комитет

СССР (23) Приоритет— оо делам изобретеиий и открытий

Опубликовано 30.04.81. Бюллетень ¹ 16

Дата опубликования описания05.05.81 (53) УДК 668.392 (088.8) (72) Авторы изобретения

П. И, Гвоздяк и Н. Ф. Могилевич! ,>

> с.

Институт коллоидной химии и химии воды

АН Украинской CCP (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ДЕЗИНТЕГРАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Изобретение относится к микрсюаологии и может быть использовано в исследовательской работе микробиологической, пишевой и медицинской промышленностях для разрушения клеток и получения из них белка, нуклеиновых кислот, антигенов и дру5 гих ценных биологически активных вешеств.

Известны способы дезинтеграции микроорганизмов (баллистические, экструзионные), предусматривающие экструдирование то суспензий клеток, а также различные типы помола или дробления клеток микроорганизмов: химические, при которых биомасса микроорганизмов. подвергается обра15 ботке химическими реагентами, например, кислотами, щелочами, солями, детергентами, антибиотиками, сжиженными газами„ биологические, предусматривающие лизис культур микроорганизмов под воздействием ферментных препаратов, фагов, внутриклеточных паразитов и т.д., и физические, при которых клетки микроорганизмов под вергаются высушиванию, регидратации

2 сильным и сверхсильным воздействиям, способным вызвать гидродинамические градиенты (обработка ультразвуком, газодекомпрессия) (1), а также электровоздейс твие (2).

Недостаток известных способов — orсутствие универсальности.

Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту способ дезинтеграции микроорганизмов, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов и ее обработку электрическим полем. Способ предусматривает погружение электродов во взвесь культуры и осуществление электрических разрядов. Мощность таких разрядов достаточно высока до 1000 Ък, а используемое напряжение электрического поля на электродах составляет 30000-40000 В.

При высоковольтном электроразряде возникает целый ряд явлений, обьединенных под общим понятием электрогкдравлич>"o— кий эффект, а именно> ра:>рядная плазма, мощные ударные BGJIllfI нарушение целост3 МЬЬМ

4 мости жидкости, высокая ионизация, ульт- Н табл. 2 приведено влияние напряженразвуковые излучения и др. Электрогид- ности электрического поля на выход белка равлический эффект оказывает сильное раз- при дезинтеграции. рушающее действие на клетки микроорга- Влияние вре)кени воздействия неоднороднизмов 13) .. ного электрического поля постоянного гоНедостатком способа является слож- на на выход белка при дезинтеграции поВ ность проведения процесса дезинтеграции ызвно в табл. 3. . клеток, обусловленная использованием вы- Из табл. 1 видно, что наиболее бласоковольтного электрического поля, а так- гоприятные условия для разрушения микже то, что для проведения дезинтегра- tg робных клеток создаются при исиользовации необходима соответствующая аппара- нии .анионобменной смолы АВ-17. В это тура (высоковольтные масляные трансфер- случае отмечен максимальный выход белматоры, конденсаторы значительной емко ка, значение РН водного раствора которо сти, зарядные сопротивления и т.д. ). го близко к нейтральному (РН 6,55).

Цель изобретения — упрощение процес- Нри. использовании смеси ионобменных са дезинтеграции микроорганизмов. смол, содержащих различное весовое соот

Поставленная цель достигается обработ- ношение анионобменной смолы АВ-17 и кой суспензии микроорганизмов в электри- катионобменной смолы КУ-2, наблюдается ческом поле в присутствии анионобменных практически одииаковый выход белка в или катионобменных смол или их смесей. >О пределах 0,6-0,65 оптических ед. ЗначеПри этом обработку проводят электри- ние РН растворов белка равно,5,5-6,0. ческим полем постоянного йли переменно- Такое же количество белка получается при го тока напряженностью 10 75 В/см использовании катионобменной смолы КУ-1. предпочтительно 25-30 В/см, а в случае Однако значение РН раствора белка в этом использования смеси анионобменных и ка- случае смещено в кислую сторону (рН тионобменных смол последние берут в со 4,7). Это следует иметь в вмду при деотношении от 4:1 до 1:4. трукции микроорганизМов и получении

Пример 1. 2 r сырых. дрожжей белка, оптимум РН работы которого лежит

Басс%агоеЪсйв csmv e at - суспенди- в кислой среде. руют в 5 мл дистиллированной воды вмес- Данные табл. 2 показыв .. гто наибоЗО те с 8 г смеси ион бменн смол АВ-17 лее оптимальным у вием дезинтеграции и КУ-2 в весовом соотношении 1:1, поме микроорганизмов являтся напряженность щают в электрическое поле постоянног х электрического поля 25-50 В/см, так как тока напряженностью 25 B/см. ЭлектРМ " .. снижение напряженности приводит к ухудотделены от реакционной массы токопр шению дезинтеграции и меныфему выходу водящими пластинами. Через 5 мин eaezr- з белка, а увеличение сопровождается снирическое поле отключают, деэинтеграт от- жением РН, а также может наблюдаться деляют от ионобменных смол, а последние повышение температуры, что приводит к дополнительно промывают 5 мл Фистилли- инактивации ферментов. рованной воды. К полученному об%ему дез- Из табл, 3 следует, что достаточное интеграта добавляют 10 мл 1/15 М фос- время обработки суспензии микроорганиз4С фатного буфера РН 7,2 и центриФУГируют. мов составляет 5 мин.

В суцернатанте" с помощью ультрафиолето Пример 2. В 15 мл суспензии вого спектрофотометра Бресогб ОЧ- Я% бактерий Sac eeus Вц(рМИв 21/Ъ устанавливают наличие белка tt нуклеино активно дестр т а гексаметилендиамивых кислот,, на (ГМД),- содержащей 100 млрд клеток

ЙлЯ опРеделениЯ оптимальных Режимов в 1 мл, добавляют 8 г смеси ионобменных обРаботки сУспензии микрооРганизмов эле- смол АР 1 7 и КУ-2 в,соотношении 1:1 и ктрическим полем изучают влиЯние соста- помещают в электрическое поле постоянва ионобменных смол, напРЯженности эле- мого тока напряженностью 25 В/см. После ктрического поля (табл. 2) и времени воэ. 50 5 мин выдержки в электрическом поле дедействия электрического поля (табл,З) на зинтеграт отделяют от ионобменных смол. степень разрушения микрабньп клеток и . K полученному дезинтеграту добавляют выход белка. фосфатный буфер РН 7,2, центрифугируют

3 0,мин при 6000 об/мин и в надосадочВлияние соотношения ионобменных смол H - jpI жидкости устанавливают наличие белна содержание и РН белка, полученных при яй на ультрафиолетовом спектрофотометре дезинтеграции В сс.*дготпжвв сатч ВЧцв бреоот 4 Vy -wag. В супернатанте представлено в табл. 1. содержащем белок, обнаруживают фер

825626 электрическое поле отключают, дезинтеграт отделяют or ионобменных смол и центрифугируют. Осадок проверяют с помощью микроскопа на степень .дезинтеграции, анадосадочную жидкость — на наличие бел-ка и нуклеиновых кислот с помощью ультрафиолетового спектрофотометра Бресог4

ЦЧ вЂ” V39.

Как видно из приведенных данных, пред4, лагаемый способ дезинтеграции значительно упрощает процесс разрушения микроорганизмов, так как предусматривает использование электрического поля низкой напряженности (порядка 25-50 В/см), что примерно в 1000 раз меньше, чем в известном способе. В предлагаемом способе исключае".ся необходимость использования специального высоковольтного оборудования, при от- делении. электродов от реакционной смеси токопроводящими пластинами сводится к минимуму вероятность протекания механо-химических реакций между вещества.— ми и газами, образующимися на электродах, в дезинтеграторах.

Таблица 1

АВ-1 7: КУ-2, весовое сорН води,ого дезинтеграта рН раствора белка после добавления фосфорного буфера

Содержание белка в супернатанте ед. оптической плотности. отношен ие

1:0

6,55

7,2

1,05

4:1

5,9

0,65

7,2

2:1

5,7

7,2

0,62

0,62, 0,58

0,56

0,58

0,58

1,5-1

5,65

7,15

7,15

7,15

5,6

l:1,5

5,5

1:2

5,5

7,15

1:4

5,4

7,15

0,62

4,7

7,15

П р и м е ч а н и е: E=25 В/см; 4 =5 мин.

Таблица 2 рН водного дезинтеграта .

Напряженность, В/см

0,4

5,9

0,64

5,65

0,69

4,95

0,7

4,85

П р и м е ч а н и е: АВ-17: КУ-2=1: 1; $ =5 мин. ментативную активность в отношении

ГМЙ к 1 мл раствора белка, добавляют

1 мл ГМЙ в концентрации 1 г/л и инкубируют 5.мин при 32 С. По истечении периода ийкубации определяют остаточ- s ную концентрацию ГМД в пробе с помощью реакции с 2,4-динитрохларбензолом. Опыты показывают, что после 5 мин контакта белка с ГМЙ, последний полностью отсутствует в реакционной смеси или обна10 руживается в виде следов. Наличие активности белка в отношении ГМИ свидетельствует о разрушении исследуемых клеток, l так как известно, что гексаметилендиамин — гидролизующий фермент находится внутри клеток и не выделяется в среду.

Пример, ЗР 2 г сырых дрожжей

5ассФ сцое сеа сегЕЧ В ае суспендируют в 5 мл дистиллированной воды перемешивают с 8 г смеси ионобменных смол в соотношении 1:1 и помещают в переменное электрическое поле промышленной частоты (50 Гц) напряженностью 25. В/см.

Электроды отделены от реакционной смеси тшишвоводяшими пластинами. Через бмин

Содержание белка в супернатанте, ед. оптической плотиocr v

А !", 2д

Таблица 3

Содержание белка в супернатанте, ед. оптической плотности рН водного дезингегра ra

Время обработки, мин

0,48

0,58

5 7

0,58

4,8

0,56

П р и м е ч а н и е: E=25 В/см; АВ-17:КУ-2=1:1

Составитель В, Зайцева

Редактор Л. Пчелинская Техред М.Коштура Корректор Л. Иван

Заказ 2411/48 Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1.13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., a. 4/5

Филиал ППП "Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, <Рормула изобретения

1. Способ дезинтеграции микроорганизмов, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов и ее обработку электрическим полем, о г л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения процесса, обработку суспензии микроорганизмов в электрическом поле осуществляют в присутствии анионобменных или катионобменных смол или их смесей.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем; что обработку проводят электрическим полем постоянного или переменного тока напряженностью 1075 В/см, предпочтительно 25-30 Б7см.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч аю m и и с я тем, что при использовании смеси анионобменных и кати нобменных смол последние берут в соотношении от

4-1 до 1-4.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Фихте Б. А., Гуревич Г. A. и Куд20 рявцев А. А. дезинтеграция микроорганизмов. "Итоги науки и техники". Сборник.

М., ВИНИТИ, Сер, "Микробиогия, r.8, 1978, с. 7-93.

2. Сытник И. А. и Сытник С. И. Влия25 ние электрогидравлического эффекта на микроорганизмы. — Микробиологический журнал . 40, No 44, с. 514522. е

3. Ситник С. 1 Бактерицидна s дезинфл.куюча д1я електрог1дранл1чного ефек30 ту на сгаф1лококи Микроб олог .чний журнал", 39,2, с. 180-184.