Способ определения фазового сос-тояния внутриклеточной воды

Способ определения фазового сос-тояния внутриклеточной воды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Оп ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Соиаэ Советсиин

Соцмапистмчесимн республик

<п>830212 (6l ) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 05.07.79 (2l ) 2795037/l8-25 с присоединением заявки М (5l)M. Кл.

60аN г4Л0 твеудерстввнный квинтет

СССР ао делам наебретеннй н открытий (23) П риоритет

Опубликовано 15.05.8l. Бюллетень Рм l8

Дата опубликования описания 18.05.8 l (53) УДК538. . l l.3(088.8j

Н. С. Пушкарь. В. A. Моисеев, Л. В.

В. К. Кальтовер и И. И. Гаврилова ";р у,-,.

1 Г ъ

Институт проблем криобиологии и кр медатййкы""- . :- :у "

АН Украинской CCP Бй;: „ц .т; -.

v-i.:.. (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАЗОВОГО СОСТОЯНИЯ

ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ВОДЫ

Изобретение относится к криобиологии и может найти применение при исследо"вании процессов низкотемпературного кон-. сервирования различных биологических объектов.

Одним из основных повреждающих фак5 торов клеток в процессе низкотемпературного консервирования считается внутриклеточная кристаллизация. Поэтому определение фазового состояния внутриклеточной воды является важным этапом исследования процессов низкотемпературного консервирования.

Известен способ определения фазового .-состояния воды с помощью сетевой микроскопии, основанный на изменении оптической плотности жидкой фазы при ее кристаллизации или изменении вращения плоскости поляризации света 53.

Основным недостатком этого способа является то, что при исследовании клеток малых размеров (д <.10-30 мк) происходит маскировка внутриклеточного содержимого внеклеточным льдом.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения фазового состояния внутриклеточной воды методом электронно-микроскопической криофрактографни. Согласно этому биоло- . гический образец быстро охлаждают в пе,реохлажденном пентане и раскалывают в глубоком вакууме. Затем проводят напыление платины и углерода на поверхность раскола, т.е. получают. реплику поверхности раскола в просвечивающем электронном микроскопе (2 .

Однако при изготовлении среза образца возмсакно иннцнрование внутрикле-. точной кристаллизации за счет непосредственного контакта охлажденного ножа микротома с переохлажденным внутриклеточным содержимым. Из-за малой разре.-. шающей способности трудно идентифицировать реплики граней кристаллов льда, особенно малых размеров.

Бель изобретения - повышение точности определения фазового состояния внут риклеточной воды.

02l2 4

Источники информашж, принятые во внимание при экспертизе

Веге" К 3- 6" ае о Е.G., н %% -...

ЗНГаСЕВРООаГ FreeZing in Hiarnateria00; CVоЬ1оВо ". 4972, Y. 9. р. 429-44-0, 55

2. ВОРбусв1 8. Fre

2.68, 89, Р. 5- И (пРатоти11).

3 83

Указанная цель достигается тем, что в способе определения фазового состояния внутриклеточной воды, основан. Ного на охлаждении биологического образца и последующего анализа состояния воды внутри клетки, исследуемую взвесь клеток вводят в воднйй раст вор, содержащий иминоксильный радикал концентрацией ИГ 2. 10 М и парамагнитную соль концентрацией l- 2 М, после чего по мере охлаждения регистрируют спектр ЭПР иминоксильногб радикала, проникшего внутрь клетки, по . виду которого судят о фазовом состоянии внутриклеточной воды.

На фиг. 1-5 изображены спектры

ЭПР, наблюдаемые в процессе осуществления способа.

Способ осуществляют следующим образом

В стеклянную ампулу, вводят О,ll,0 мл водного раствора иминоксильного радикала концентрацией 10 2 ° lO М и на радиосцектрометре наблюдают сигнал

ЭПР (фиг. l). Затем в ампулу добавляют

О,l-l,0 мл водного раствора парамагнитной соли, концентрацией 1-2 M. В результате обменного взаимодействия сигнал

ЭПР от минимального радикала полностью уширяется и исчезает (фиг.2) Затем в ампулу вводят 0,8-8,0 мл взвеси биологического объекта, разведенной физиологическюл раствором (1:5), и наблюдают сигнал ЭПР от радикалов, проникающих внутрь клетки (фиг.3). Парамагнитные ионы в норме через биологическую мембрану не.проникают, что позволяет следить за сигналом ЭПР радикалов в цитоплазме клетки. Затем раствор охлаждают со скоростью З-5 мин и наблюдают спектр ЭПР.

Цид и форма линии спектра ЭПР иминоксильного радикала зависит от характера и скорости вращательной диффузии радикала в растворителе, которая резко меняется при переходе из жидкой фазы в твердую в.случае замерзания раствора.

Причем спектры ЭПР радикала внутри клетки различны, в зависимости от того, кристаллическое или стеклоофазное состояние твердой фазы внутри клетки. В первом случае-кристаллы льда вытесНяют радикалы друг к другу и сигнал ЭПР представляет широкую линию (синглет) (фиг.4). B случае стеклообразного состоя ния при замораживании радикалы равномерно распределены в объеме внутри клет ки и спектр ЭПР имеет вид, показанный, на фиг. 5.

Пример. В стекланную ампулу вводят О,l мл водного раствора иминоксильного радикала концейтрацией 10Ъ/л и на радиоспектрометре наблюдают сигнал ЭПР (фиг. l). Затем в ампулу добавляют 0,1 мл водного раствора парамагнитной соли Й С32 концентрацией l M.

После исчезновения сигнала ЭПР от иминоксильного радикала (фиг.2) в ампулу добавляют 0,8 мл взвеси фибробластов, разведенной физиологическим раствором (l:5) и наблюдают сигнал ЭПР от радикалов, проникших внутрь клетки (фиг.З), Затем взвесь фибробластов с введенными внутрь цитоплазмы радикалами охлаж о дают со скоростью 3 С/мнн и набшодают спектры ЭПР радикалов внутри клетки о о через каждые 2 С. При — 45 С (тем-. пература кристаллизации) во взвеси фиб-, робластов появляется сигнал ЭПР, ха, рактеризующий кристаллическое состояние воды внутри клетки (фиг.4) °

Таким образом, данный способ позволяет однозначно определить стеклообразное и кристаллическое состояние воды внутри клетки в процессе ниэкотемпературного консервирования, не повреждая при этом ее структуры, что дает дополнительную информацию при разработке новых способов ниэкотемпературного консервирования биологических объектов.

Формула и э о б р е т е н и я

Способ определения фазового состоянтя внутриклеточной воды, основанный на охлаждении биологического образца и последующего анализа. состояния Ьоды внутри клетки, о т л и ч а ю ш и й-с я тем, что, с целью повышения точности определения, исследуемую взвесь клеток вводят в водный раствор, содержащий иминоксильный радикал концент-2. -2 рацией lO -2. 10 M и парамагнитную соль концентрацией 1-2 М, после чего по мере охлаждения регистрируют спектр

ЭПР иминоксильного радикала, проникшего внутрь клетки, по виду которого судят о фазовом состоянии внутриклеточной воды.

830212 аказ 279l/26 Тираж 907 Подписное

ВНИИПИ Государственног с комитета СССР

- цо делам изобретений и открытий

1.13035, Москва, Ж-Зб, Рауаюкая наб., д. 4/б

Филиал-ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 составитель В. Покатилов

Редактор Т. Веселова Техред Н.Келушак Корректор В. Бутяга