Способ получения протеина

Способ получения протеина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик ()837329 (61) Дополнительный к патенту (51}м. кл.з (22) Заявлено 30,1277 (21) 2559006/30-15 (23) Приоритет- (32) С 12 P 21/00

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений *. и открытий (31) (33) (53} УДК 547.96 (088.8) Опубликовано 0706.81,Бюллетень М21

Дата опубликования описания 070681

Иностранец

Дональд Оливер Хитцман (США) (72) Автор изобретения

1 \

Иностранная фирма

"Филипс Петролеум Компани" (США) (71) Заявитель (5 4 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНА

Изобретение относится к областимикробиологии, а в частности. к получению протеина путем микробиосинтеза.

Известен способ получения белка с помощью аэроб ного культивирования при температуре 45-65 С в водной среде, содержащей источники углерода азота и миниральных веществ и Penicillium notatum-chrysagenum (1).

Недостатком известного способа является невысокий выход протеина.

Целью изобретения является повышение выхода протеина, Поставленная цель достигается тем,15 что в качестве исходной культуры микроорганизма для получения протеина используют термофильную смешанную культуру NRRL B-8158, Термофильная смешанная культура бактерий состоит из трех отдельных видов бактерий. Эти бактерии классифицируются как (1) крупные грамположительные изогнутые палочки, 25 подтип бактерии, класс Sch zoeyceафв, отряд Enbacteriales, семейство

BaciIlaceae род Bacillus, (2).крупные грамотрицательные палочки, подтип бактерии, класс Schilomycetes, 3() г гряд Enbacteriales, семейство Bacillaceae, род Bacillus (3) мелкие грамотрицательные палочки, подтип бактерии, класс Schizomycetes. Смешанная тремофильная культура проявляет ценные свойства. Эта-смешанная культура (М ) растет лучше при высоких температурах, чем при обычных, с большим выходом клеток и уменьшейной тенденцией к пенообразованию в условиях ферментации.

Эта смешанная культура является термофильной, растет эффективно с высокой продуктивностью на сырье иэ окисленных угчеводородов, в часчастности, низших спиртов, наиболее предпочтительно из метанола или. этанола, при таких температурах, при которых большинство других известных видов бактерий либо относительно непродуктивны, либо просто не могут существовать, либо непродуктивны и нетолеранты к сырью

:иэ окисленных углеводородов.

Термофильная смешанная культура сдана на хранение в Министерство сельского хозяйства CBlA„ Служба сельскохозяйственных исследований, Северно-центральный район, Север837329 ный региональный .исследовательский центр, 1815 North t)niversity Street

Peoria, J11inois 61604, в количестве тридцати лиофильных препаратов смешанной культуры до подачи настоящей заявки, и ей присвоен номер NRRL

B-8158, Эта смешанная ку,".ьтура М является высокопродуктивной при срзвнительно высоких температурах ферментации и продуцирует требуемые и ценные одноклеточные протеиновые продукты с ,высоким содержанием протеина в виде. аминокислот требуемого типа и в требуемом соотношении.

Термофильная смешанная культура имеет постоянный состав. Смешенная культура, применяемая для лиофилизации, была выделена из серии ферментационных испытаний и лиофилизована при обычных условиях, которые заключаются в быстройм замораживании микробных клеток при,очень низкой температуре с последующим быстрым обезвоживанием в высоком вакууме.и хранении при комнатной температуре ° С целью определения жизнеспособности некоторых лиофилизированных образцов лиофилизированные смешанные культуры были затем реактивированы и подвергнуты выращиванию в таких же условиях, которые применялись ранее. Последующая Фермрнтация с применением реактивированной М культуры показала, что в восс становленной культуре имеются те же три разновидности микроорганизмов в той же форме и в той же взаимосвязи, как и в источнике ферментации, Культура обеспечивает достижение больших скоростей получения одноклеточного протеина при уменьшенной потребности в охлаждении, при выращивании на питательной среде, которая в качестве источников углерода и энергии представляет собой окисленный углеводород, предпочтительно низший спирт, более предпочтительно метанол или этанол, лучше предпочтителен метанол или содержащая в основном метанол питательная среда.

При использовании смешанной культуры достигается большой выход клеток который определяется в граммах полученных клеток на 100 г использованного источника углерода и энергии, например метанола.

Смешанная культура способна продуцировать одноклеточный протеин, который представляет собой смесь нескольких разновидностей клеток, поэтому получаемые из М микробные клетки характеризуются лучшими соотношениями аминокислот, чем продукты, получаемые из одной чистой культуры.

Был взят образец почвы на глубине

6,1 см от поверхности земли, покрывающей паропровод в Bart lesv5.lie, Oklahoma, Research СеИ1ег of phillips Petro.—

leum Co. Была применена обычная методика обогащения в присутствии метанола для выделения отдельных или особых культур. Получена стабильная по сЬставу смешанная культура термофильных микроорганизмов.

Термофильная смешанная культура состоит иэ трех отдельных микроорганизмов. Три типа бактерий в стабильной по составу термофильной смешанной культуре описаны как (1) крупные грамположительные изогнутые палочки, (2) крупные грамотрицательные палочки и .(3) мелкие грамотрицательные палочки.

На рифленых пластинах получили изолированные колонии всех трех микроорганизмов на минеральном агаре, содержащем метанол. Однако, когда выделенные колонии были перенесены в водные среды для дальнейшего роста

20 с метанолом в качестве источника углерода и энергии, роста культуры не было.

Совместный рост этой смешанной культуры указывает на симбиотическую смесь всех трех видов микроорганизмов. По-видимому. продукт или продукты обмена микроорганизмов по меньшей мере одного вида служат питательной средой, необходимой для роста микроорганизмов другого или других видов. Природа этого продукта обмена в точности пока еще не известна.

Можно предположить, что этот продукт обмена токсичен для микроорганизма, .которые его вырабатывает, поэтому для продолжения нормального . роста этого микроорганизма необходимо присутствие другого микроорганизма, который потребляет этот токсичный для первого микроорганизма пРодукт обмена .

Другим подтверждением такого симбиоза .является тот факт, что при

Ферментации с применением М образуется значительно меньше пены в типовых условиях аэробной ферментации по сравнению с количеством пены, образующейся обычно в равноценных типичных условиях аэробной Ферментаг ции, но с применением чистых термо5О фильных бактерий рода Bacillus. Возможно,что М не образует такого большого количества пены, которое следоsano бы ожидать, потому что при ферментации с применением М© внеклеточный продукт, вероятно протеийового характера, поглощается микроорганизмами, по меньшей мере, одного из симбиотических видов, таким образом этот продукт, являющийся пенообразователем, непрерывно выводится из

60 ферментационной смеси.

Источником углерода и энергии (или питательной средой) является окисленный углеводород. Окисленные углеводороды включают спирты, кето837329 ны, сложные и простые эфиры, кислоты и адельгиды, которые в основном являются водорастворимыми и предпочтительно содержат до 10 атомов углерода в молекуле.

Например, метанол, этанол, пропа.нол, бутанол, пентанол, гексанол, 1,7-пентандиол„ 2-гептанол, 2-метил4-пентанол, пентановая кислота, 2-метил-бутановая кислота, 2-пентанол, 2-метил-2-пропанол, 2-пропанол, муравьиная кислота, уксусная кислота, пропановая кислота, формальдегид, ацетальдегид, пропаналь, бутаналь, 2-метилпропаналь, бутановая кислота, 2-метилпропановая кислота, пентано— вая кислота, глутаровая кислота, гексановая кислота, 2-метилпентановая кислота, гептандикарбоновая кислота, гептановая кислота, 4-гептанон, 2-гептанои, окатановая кислота, 2 -этилгексановая кислота, глицероль, этиленгликоль, пропиленгликоль, 2;пропанон, 2-бутанон, диэтиловый эфир, метилэтиловый эфир, диметиловый эфир, ди-и-пропиловый эфир, и-пропилизопропиловый эфир, включая смеси любых двух или более из этих веществ.

Нефтяные газы, например природный газ, метан, или другие газы, например этан, могут быть окислены для получения смесей с преобладающим содержанием соответствующих спиртов, а также небольших количество кетонов, альдегидов, простых эфиров и кислот.

Предпочтительны спирты с С, -С в молекуле. К ним относятся спирты как с линейной, так и с разветвленной цепью, первичные, вторичные и третичные, одноатомные и многоатомные.

В качестве примеров спиртов можно привести метанол, этанол, пропанол, бутанол, пентанол, гексанол, 1,7-гептандиол, 2-гептанол, 2-метил-4-пентанол, 2-пеятанол, 2-метанол-4-бу танол, 2-метил-3-бутанол, 2-бутачол, 2-метил-1-процанол, 2-метил-2=пропанол, 2-пропанол, глицероль, этиленгликоль, пропиленгликоль, включая смеси любых двух или более из этих веществ.

Наиболее предпочтительными спиртами являются спирты, содержащие С;С4 в молекуле,.особенно одноатомные спирты, вследствие их доступности, водорастворимости и экономичности.

Особенно предпочителен метанол, потому что относительно дешев, легко доступен. и растворим в воде.

Как.правило, подвод молекулярного кислорода к водной ферментационной реакционной смеси может быть осуществлен путем пропускания адекватных объемов воздуха или обогащенного кислородом воздуха или отдельно воздуха и чистого кислорода в возрастающем количестве через ферментационный сосуд. Отходящие газы могут быть регенерированы и при необходимости поданы на рециркуляцию с целью максимального использования кислорода, например, путем отгонки углекислого газа и отходящих газов и рециркуляции.

Расход подаваемого в ферментацион- ную смесь воздуха 0,1-10, чаще 0,72,5 объемов воздуха в 1 мин на объем жидкости в ферментационном аппарате, или, в пересчете на кислород

10 соответственно 0,02-2,1 и 0,14-0,55.

Давление может изменяться в очень широком интервале, например 0,1100 атм/10,13-10132 кПа/, чаще 130 атм/101,3-3039 кПа/, предпочтитель15 но 1-5 атм/101,3-506,5 кПа/. Давление выае атмосферного имеет то пре.имущество, что оно приводит к увеличению содержания растворенного кислорода в водной ферментационной среде, Щ что в свою очередь способствует ускоренному росту микроорганизмов. Це лесообразно применять давление выше атмосферного особенно та, как высокая температура, при которой ведется термофильная ферментация, вызывает понижение растворимости кислорода в водной Ферментационной среде.

Выращивание М смешанных бактерий из сырья из окисленных углеводородов может быть успешно осуществлено при 45-65сС, предпочтительно, для достижения оптимальной скорости роста, 50-60 C. Более низкие температуры подавляют рост бактерий.

Высокие концентрации некоторых из описанных источников углерода и энергии, например метанола, могут подавлять нормальный рост микроорганизмов или быть даже токсичными для микроорганизмов, применяемых для Фер40 ментации с использованием смешанной культуры, и их следует избегать.

Процесс ферментации может быть .осуществлен периодически или непрерывным способом. Непрерывный способ

45 особенно выгоден, когда источником углерода и энергии является низший спирт, например метанол или этанол расход которого может быть легко автоматизирован. Применение такихмикроорганизмов и такого сырья в периодическом Ферментационном процессе считается неэкойомичным, Однако при непрерывном процессе ферментации такие питательные среды высокоэффективны и экономичны. При ферментации, после того как в ферментаторе надлежащим образом произведен посев смешанной культуры, окисленный углеводород может быть добавлен в .виде отдельного потока, либо он может фО быть смешан с водой в виде водного потока с целью ее стерилизации или с минеральной средой с целью ее стерилизации, или же могут быть осуществлены все эти варианты сразу.

5 Обычно окисленный углеводород пода837329

Количество

Компонент

Н РО4 (85%-ная) KCf

1 г

Mg SO ° 7Н О

3()

СаСВ - 2Н О

1,5 г

0,2 г

0,1 г

NaCl

З5 Раствор, содержащий следы минеральных веществ

Дистиллированная

40 вода

До 1л

Количество

Компонент

CuSO< ° 5Н О

К3

0,06 г

0,08 r

4,80 r

0,30 r

0,20 г

2,00 г

0,02 r

FeCX> бН О

М

ИпЯО Н О

NaMoO 2H О

KnSOJ„ ° 7Н О

И ВО

Н, 0„,(конц.) Дистиллированная у5 вода

o1л ется отдельно для удобства регулирования концентрации в поступающем в ферментатор потоке в интервале

2,5.-35 вес.В, чаще 10-15 sec.В.

Рост микроорганизмов осуществляется в водной питательной среде, содержащей водный раствор минеральной соли, источник углерода и энергии, молекулярный кислород и исходный . посевной материал смешанной культуры

Мс

Скорость ферментационного роста можно регулировать путем регулирования подачи окисленного углеводорода.

Скорость подачи источников углерода и энергии в ферментатор следует регулировать так, чтобы она в основном была равна скорости потребления его мйкроорганизмами во избежании значительного накопления в ферментаторе, в частности, каких-нибудь токсических веществ. Удовлетворительный контроль может быть достигнут также путем проверки содержания непрореагированного питательного материала в выходящем иэ ферментаторов потоке, оно должно составля ть 0-0,2 вес.Ъ.

Обычно, при вышеприведенных условиях, время нахождения микробных клеток в ферментаторе при непрерывном процессе составляет приблизительно

2-4 ч, хотя оно не имеет решающего значения.

Кроме вышеописанных молекулярного кислорода и источника углерода и энергии, культуре М требуются также ьжнеральные питательные вещества и источник усвояемого азота. Источником азота может быть любое азотсодержащее соединение, способное выделять азот в виде, удобном для обменного поглощения организмами. Хотя могут применять различные органические источники азота, например другие протеины, мочевина или т.п., но обычно неорганические источники азота более экономичны и удобны для практического применения. В качестве примера таких неорганических азотсодержащих соединений можно привести аммиак или гидроксид аммония, а также различные соли аммония, например карбонат аммония, цитрит аммония, фосфат аммония, сульфат аммония и пирофосфат аммония. Удобно применять газообразный аммоний, который можно барботировать в соответст,вующих количествах через водную ферментационную среду. рН водной микробной ферментационной смеси 5,5-7,5 предпочтительно

6-7. Подача аммиака способствует поддержанию требуемых значений рН, так как иначе водная среда становится слабо кислой. Вообще интервал предпочтительных значений рН для микроорганизмов в какой-то степени эави сит от применяемой среды, поэтому предпочтительный интервал значений рН может изменяться незначительно при изменении минеральной среды.

Кроме источников кислорода, азота и углерода и энергии, необходимо к питательной среде добавлять выбранные минеральные питательные вещества в необходимых количествах и соотношениях, чтобы обеспечить правильный рост микроорганизмов и максимальное усвоение окисленного углеводорода клетками в процессе микроб<О ной конверсии.

Источники фосфат-ионов или других ионов фосфора, а также ионов магния, кальция, натрия, марганца, молибдена и меди обеспечивают потребность

35 в основных минеральных веществах.

Для ферментационного процесса целесообразно применять приведенную ниже минеральную питательную среду (1.M-12), которая содержит еще в ка2()честве компонента раствор, содержащий следы минеральных веществ.

Раствор, содержащий следы минЕральных веществ, приведен ниже.

837329

Через 22 ч минеральную среду заменили водным составом, содержащим

7,5 об.Ъ метанола в дополнение к среде FM-12 плюс 0,75 r хлорида калия, 55 удвоенное против нормального коли,— чества следов минеральных веществ, утроенное против нормального количества марганца (все дается в расчете на 1 л) и не содержащим хлорида натрия. После 166 ч питательная среда била заменена водным средством, содержащим 10 об.Ъ метанола, 2,5.мл фосфорной кислоты (85%) на

1 л, 2 г/л хларида калия, 1,75 г/л

65 NgSC4 ° 7Н О, 0,25 г/л СаСС 2Н„О, Могут применяться также и другие концентрации минеральной среды. Значения которых приведены в примерах.

До начала работы либо в периодическом либо в непрерывном режиме все оборудование — реакторы или устройство для ферментации, сосуды или

5 сборники, циркуляционные или охладительные устройства и т.п. - должНо быть стериализонано, например, паром при температуре по меньшей мере

121 С в течение нескольких минут, например 15 мин. Затем стерилизованный реактор засевается культурой н присутствии всех требуемых питательных веществ, включая подачу молекулярного кислорода и окислен- 15 ного углеводорода.

Могут применяться контрольноизмерительные приборы для изменения плотности клеток, рН„ содер-. жания растворенного кислорода, 20 концентрации окисленного углеводорода н ферментаторе, температуры, скоростей подачи и т.п. Предпочтительно, чтобы подаваемые в ферментатор мате- риалы были стерилизонаны до поступления 5 в ферментатор. Если окисленный углеводород представляет собой вещество, способное стерилизовать другие материалы, например этанол или метанол, то целесообразно добавлять его в другие потоки, например в минеральную среду, в достаточном для стерилизации количестве.

Следует избегать добавления протинопенных веществ к ферментационной смеси, так как протинопенные добавки, например снликоны, могут оказывать вредное действие на содержание растворенного кислорода при рекомендуемых повышенных температурах ферментации и могут вызвать замедление роста 40 микроорганизмов или их гибель. Пена, образуемая культурой N, не вредит росту и определенно благоприятстнует поддержанию микроорганизмов в системе с высоким содержанием растворенного кислорода. Пена способстнует поддержанию относительно большой поверхности раздела на границе газ/ жидкость. Таким образом, ферментация улучшается и улучшается теплопередача, ее регулирование, равномерность и отсутствие точек перегрева °

При желании можно применять пенообразователи. например детергенты, предпочтительно неионные.

Выделение микробных клеток может быть осуществлено обычными способами, например путем подкисления вытекающего из ферментатора потока до рН приблизительно 4 и нагрева подкисленного потока до температуры, убивающей микроорганизмы, например приблизительно до 80оС, причем нагревать следует медленно, чтобы не повредить протеиновый продукт.

Затем вытекающий поток можно центрифугиронать,, промыть, снова центрифугиронать для отделения микробных .клеток от вытекающего из ферментатора потока, Клетки могут быть обработаны, чтобы вызвать разложение с целью облегчения извлечения иэ. них протеина и других веществ. В Процессе ферментации образуются также нужные побочные продукты, которые могут быть извлечены из вытекающей иэ ферментатора жидкости. Эти внеклеточные продукты могут повысить экономичность процесса в целом, так как среди них имеются ценных продукты, например полисахариды, аминокислоты, например глутаминовая кислота, энзимы, витамины и т.п.

Одноклеточный протеиноный продукт является ценным источником протеина как для людей, так и для животных. Для питания людей клетки при желании можно обработать с целью уменьшения содержания ну.<леиновой кислоты, но для питания животных в та кой обработке нет необходимости.

Пример 1. Проведена опытная непрерывная ферментация с применением термофильной смешанной культуры. В ферментатор емкостью 7 л, оборудованный азратором, мешалкой, прибором для регулирования подачи кислорода и устройствами для изменения и регулирования температуры и рН ферментационной смеси, загрузили н качестве посевного материала около 500 мл ферментационной реакционной смеси из предыдущей опытной . Ферментации с применением термофильной минеральной питательной среды М-12, В ходе опыта поддерживают скорость перемешивания 1000 об/мин и рН 6,26,35 путем добавления при необходимости раствора гидроксида аммония.

Расход подаваемого в ферментатор воздуха был 2 л/мин во время опыта. Через 6 ч в ферментатор стали подавать также в основном чистый кислород со скоростью 0,5 л/мин,через 113 часов расход довели. до 0,75 л/мин, через 174ч — до 1,5 л/мин и через

190 ч — до 2 л/мин.

837329

20 мл/л водного раствора (0,3 г/л)

MnSO4 ° Н О и 35 мл/л ранее описанного раствора, содержащего следы ми- неральных веществ.

Пробы вытекающей ферментационной жидкости отбирались время от времени для извлечения из них клеток.

Полученные значения содержания клеток в расчете на сухой вес клеток в граммах на 1 л, вычисленные значения продуктивности в граммах клеток на 1 л в 1 ч, вычисленный выход пред ставлены в табл. 1.

Таблица 1

М I

Показатель при времени, ч

Наименование

46 118 166 190 286 358

2,27 2,38 2,83 2,33 2,43

27,13 27,04 35,21 35,53 35,57

Твердые вещества, г/л 26,82 27,66

Выход клеток,% 44,7 46,1

Продуктивность, r л ° ч 11 4 12 2

11 7 12 5 15 7

Приблизительно через 126 ч были отобраны пробы ферментационной смеси, которые были подготовлены для лиофилиэации микробных клеток по известной методике. Затем зти лиофилизованные пробы хранились для последующего исполь зования в опытной ферментации и для передачи на хранение образцов HTB-53 хранителю микроорганизмов, уполномоченному Министерством сельского .хозяйства CILIA. Северная региональная ис- . следовательская лаборатория в Пеории, штат Иллинойс.

Периодически пробы отбирались так- " же иэ ферментационной реакционной смеси с целью микроскопического ис- следования морфологии клеток. Такое микроскопическое исследование показало, что культура Мо состоит из крупных грамположительных изогнутых палочек, крупных грамотрицательных палочек и мелких грамотрицательных палочек. Изредка наблюдались, также крупные грамположительные (не изогнутые) палочки, но можно думать, что зто временный вариант крупных изогнутых грамположительных палочек. а) Значение получено путеМ выпаривания при 100 С 10.мл пробы вытекаю- 5 щей из ферментатора жидкости и вычитания веса минеральных твердых веществ, содержащихся в 10 мл среды: в) значение получено путем центрифугирования 100 мл пробы вытекающей из ферментатора жидкости, повторного суспендирования твердых веществ в дистиллированной воде и повторного центрифугирования для отделения твердых веществ, которые затем высушивались в течение ночи при 100 С," 45

Компонент

2,0 г

3,0 г

КН РО

К НРО4

0,4 г

0,04 г

0,1 г

2 0 г.

МдБО4 7Н О

СаСЮ 2 И О

NaCI (НН4)g 04

Раствор, содержащий следы мйнеральных веществ

Дистиллированная

0,5 мл

Скорость подачи среды составляла от 700 мл/ч в первые 22 часа.до

817. мл/ч через 118 ч, 781 мя/ч через 166 ч и 763 мл/ч черээ 382 ч, Продолжительность пребывания, ч 2,36

Клетки, г/л 26,36

27,87 35,5 Зб,бб 36,76 46,47 - 44,4 45,8 45,9 с) значение получено путем деления количества извлеченных твердых веществ (г/л) на количество введенного метанола (г/л) к 100; ,1) значение получено путем деления извлеченных твердых веществ (г/л) на продолжительность нахождения смеси в ферментаторе (ч).

Пример 2. Приблизительно через 1 мес. одна ампула с диофилизированной микробной культурой HTB-58, полученной при опытной ферментации, описанной выше в примере 1 былавскрыта обычным способом в асептических условиях и добавлена к 100 мл ферментациониой среды, обозначенной

lN2, которая тоже содержала 0,5% метанола. Состав среды 1М2 приведен ниже.

837329

Таблица 2

L !

Показатель при времени, ч чо

Наименование

" I" Ь

Продолжительность пребывания, ч

2,63

2,60

2,70

2,64

34,84

Клетки, г/л

34,33

33,56

33,87

Твердые вещества, г/л

34,44 35,4

34,55

35,53

44,2

43,6

43,2

Выход клеток, %

44,2

Продуктивность, г/л ° ÷

13 2

13,1

13,1

l3,5

Углерод, вес.%

44,7

6,79

Водород,. вес.%

Азот, вес.%

13,7

Фосфор вес.%

Калий, вес.%

Магний вес %

1,71

0,91

0,26

Кальций, вес.%

0,1

Натрий, вес.% (0,01

Железо, м,д.

1300

Цинк, м. д.

Марганец, м.д.

55,8

126

Азот в виде аминогруппы, вес.%

65 медь, м. д.

13,4

Колбу, загруженную оживленной диофилиэиронанной культурой, подвергали инкубации при 55ОС при встряхивании.

Через 24 ч в колбе наблюдался хороший рост культуры и 5 мл.этой смеси перенесли в 10 мл среды 1М2, содержащей тоже 1,5 об.% метанола. Через 24 ч наблюдался хороший рост и был сделан третий перенос в ту же среду в две колбы, каждая иэ которых содержала

500 мн среды 1М2 плюс 1,5 об.% метанола. Третий перенос заключался в том, что в каждую из этих колб ввели по

100 мл культуры. Культуру оставили расти в течение 32 ч и затем использовали как посевной материал для опытной непрерывной ферментации в уст- 15 ройстве, описанном выше в примере 1.

В ферментатор загрузили 100 мл среды

FM-12 и 1000 мл посевного материала, к которому было добавлено 10 мп метанола. Поддержинали температуру QP

55оС, н рН 6,25-6,4 регулировали путем непрерынного добавления раствора гидВо нремя опытной ферментации были также отобраны образцы микробной культуры для микроскопического иссле- 45 донания, как описано в примере 1.

В настоящем примере обнаружены только крупные.грамположительные изогну- . тые палочки и крупные и мелкие грамотрицательные окрашивающие палочки. 50

После 238 опыта культура погибла при попытке заменить питательную среду другой средой с большей концентрацией спирта.

Пример 3. Ниже приведены ре- у зультаты .химического анализа извлеченных микробных клеток, характеризующие состав микробной культуры, полученной в опыте, описанном в примерр 1.

Сырой протейн, d0 вес.% 81,6В

Зола, нес.% 9,16 роксида аммония, как описано раньше.

Сначала, пока культура была оставле« на в ферментаторе для акклиматизации, мешалка работала со скоростью

300 об/мин, а ноэдух подавался со скоростью 0,5 л/мин. Хереэ 7 ч началась . непрерывная подача питательной среды в вышеприведенном примере 1. Кроме того, расход воздуха увеличили до

2 л/мин, а скорость мешалки унеличйли до 1000 об/мин. Спустя. 30 ч расяод воздуха уменьшили до 1,75 л/мин и стали подавать кислород в количестве

0,75 л/мин, затем после 54 ч довели количество кислорода до 1 л/мин, после 198 ч - до 1,5 л/мин. Из вытекающей ферментационной жидкости периодически отбирали пробы для определения содержания клеток в граммах на

1 л в расчете на сухой вес, а также выхода и продуктинности процесса ферментации. Данные, полученные при проведении опыта, представлены в табл. 2 °

837329

В табл. З.тоже приведено содержа.ние аминокислот в микробных клетках, полученных при другой опытной ферментации с применением смешанной термофильной культуры.. Для сравнения в табл. 4 приведено также содержание Табли е I

Содержание аминокислот, г/100 г тпродукта

Аминокислота чистая культура (HST-7) Ь, 37-.

4,56

5,54

1,50

Цистин Не обнаружена, 34 Не обнаружена 36 о

90 2, 7.9 8 8

Тресиин

2,95

Фенилаланин 2,68

2,78

Тироэии

Триптофан

2,72

80

0,89

48

0,60

5,13

121

5,46

Валин П р и м е ч а н и е s Значения химических показаний, содержание незаменимых аминокислот в яичном белке такого же веса принято за 100.

Содержание аминокислот в термофильных .культурах, выраженных на метаноле в расчете на средний резульЗаменимые аминокислоты чистая культура (HBT-7) смешанная культура (HBT-42) Алании

Аргинин

5,65

6,19

3,39

3,01

Аспарагиновая кислота

6,50

6,26

Глицерин

3,71

4,19

Глутаминовая кислота

10,47

10,69 1,26

1 22

Гистидин

Лейцин

Иволейцин

Лизин

Метиоиин,аминокислот в чистой культуре термофильного мнкрооргани зма, полученной при выделении термофильных микроорганизмов ия исходного образца почвы, .описанного ранее. ц а 3

1 значение смешан- значение химических ная куль- химичеспоказаний тура кнх пока(НВТ-42) заний о

75 5 37 104

83 4,90 118

96, 5 67 141

34 1,22 36 тат из пяти опытов с чистой термофильной культурой приведено в табл. 4.

Таблица 4 ч

Содержание аминокислот, r/100 г продукта

837329

Продолжение табл 4

Содержание аминокислот, г/100 г продукта а

Заменимые аминокислоты чистая культура (НВТ-7) смешанная культура (НВТ-42) 2,32

2,38

Пролин

Серин

1,75

2,09

Общее содержание незаменимых аминокислот

32,19

30,88

Общее содержание аминокислот 66,27

67,88

84,4. Сырой проте и н 85,63

Формула изобретения

Составитель М.Белоусова

Редактор Н.Потапова. Техред H. Келушак Еорректор В, Бутяга

«М Й

3ак as 3222/4 7 ф краж 528 Подписное

ВКИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Можно видеть, что общее содержа-ние незаменимых аминокислот несколь-. ко выае у продукта смешанной культуры (47%), чем у продукта полученного из чистой культуры (46%). Далее если незаменимые серусодержащие аминокис,лоты вводится путем добавления синтетического метионина, то значения химических-показаний указывают на то, что продукт, полученный на смешанной культуре, вдвое лучше с точки зрения питательной ценности продукта, полученного на чистой культуре в расчете на ближайшее низшее значение химических показаний для незаменимых аминокислот.

Способ получения протеина с помощью аэробного культивирования культуры микрос.зюганизма в водной среде, со25 держащей источники углерода, азота и минеральные питательные вещества., отличающийся тем, что, с целью повышения выхода протеина, в качестве исходной культуры микроорганизма используют термофильную культуру NRRL В-8158.

Источники информации, принятые во внимание при эксперты е

1. Патент СССР 9 572209, кл, С 12 D 13/06, 1977.