Способ выделения стрептолизина о,гиалуронатлиазы, стрептодорназы истрептокиназы

Способ выделения стрептолизина о,гиалуронатлиазы, стрептодорназы истрептокиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДИТИЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву

{22) ЗаЯвлено О 81035 (21) 2179605/28-13 с присоединением заявки Нов (23) ПриоритетСоюз Советския

Социалистических

Республик

< >840100 (51)м. к .з

С 12 D 13/10

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 2306..81. Бюллетень N923 (53) УДК 615 779. 94 (088.8) Дата опубликования описания 23.06.81

И нос тра нцы

Дитер Герлах, Вернер Келер, и Петер Бойде (ГДР) (72) Авторы изобретения

Герхард Зервальд

Иностранное предприятие ФЕН Арцнаймиттельверк Дрезден (ГДР) {71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЦЦЕЛЕНИЯ СТРЕПТОЛИЗИНА О, ГИАЛУРОНАТЛИАЗЫ СТРЕПТОДОРНАЗЫ

И СТРЕПТОКИНАЗЫ

Изобретение относится к микро- биологической промышленности и касается получения продуктов стрептококкового обмена веществ с высокой степенью чистоты.

Предлагаемый способ новый, в патентной и научно-технической литературе не описан.

Цель изобретения. — выделение стрептолизина О, гиалуронатлиазы, стрептодорназы и стрептокиназы.

Эта цель достигается тем, что культуральную жидкость, содержащую стрептококки, подкисляют до рН 3-4, oca:.дают стрептококки с адсорбированным на них целевым продуктом, далее целевой продукт элюируют

0,1 М раствором фосфатного буфера при рН 7,5-9,5, затем осаждают его из элюата раствором сернокислого аммония, повторно элюируют 0,02 И раствором фосфатного буфера, полученный элюат хроматографируют на

ДЭАЭ-агарозе и выделяют целевой продукт элюцией в линейном градиенте.

С целью выделения галуронатлиазы полученный после элюирования 0,1 И раствором фосфатного буфера элюат разбавляют фосфатным буфером рН б,О7,0 в соотношении 1г1, добавляют двуокись кремния и перемешивают при рН 6,0-7,0, выпавший осадок отделяют, а из надосадочной жидкости осаждают целевой продукт сернокислым аммонием, осадок рас творяют, диализуют против 0,02 М раствора фосфатного буфера,и полученный диализат хроматографируют на ДЭАЭ-агарозе.

Кроме того, с целью выделения стрептокинаэы и стрептадорназы к полученному после элюирования

0,1 N раствором фосфатного буфера элюату добавляют 10%-ный раствор хлористого натрия, выпавший осадок растворяют, обрабатывают раствор фосфорнокислым кальцием и выделяют целевой продукт осаждением сернокислым аммонием и хроматографией на ДЭАЭ-агарозе.

Пример 1. 5 л стрептококковой культуры (стрептококки группы С), полученной выращиванием при 28 С и рН 7,2 и содержащей стрептолизин с активностью 128 МЕ/мл, гиалуронатлиазу с активностью 0,24 ед/мл (по Герлаху и Колеру) и стрептокиназу с активностью 4200 ед..

Христенса/мл обрабатывают концентрированной соляной кислотой до рН 3,5 и перемешивают 1 ч. Отделяют на

840100 центрифуге и отбрасывают слив, Погибшие стрептококки пропивают .2 раза фосфатным буфером по 250 мл с концентрацией 0,1 М, рН-.8,0, При этом элюируются все продукты обмена веществ. Объединенные элюаты. центрифугируют до прозрачности.и осаждают сульфатом аммония из расчета 60 г на 100 мл раствора. Осадок растворяют в 50 мл 0,02 14 Раатвора фосфат- ; ного буфера (рй 8,0) и освобождают от сульфата диализом относительно. того же буфера. Этот раствор наносят . на колонну 2,5 15 см с ДЭАЭ-агароэой,. которую приготовляют заранее промыванием колонны .1 л 0,5 н.раствора NaOH водой .и уравновешиванием .

0,02 М и раствором фосфатного буфера (рН 8,0). Элюируют с линейным градиентом, который состоит из 1 л

0,02 М раствора фосфатного буфера (pH 8,0) и 1 л смеси 0,02 M раствора фасфатного буфера с 0,4 М раствором NaCO (рН 7,6). Затем элюируют примерно при 0,01 М ИаСР стрептолизин; при 0,05 М МаСРгиалуронатлиазу> при0,1 N NaC8стрептокиназу и при 0,2 N NaCP.— стрептодорназу, Активные фракции могут быть объединены. Все операции проводят при комнатной температуре, хроматографию — при 4 С.

После обработки кислотой и отделения центрифугированием погибших стрептококков в фильтрате культуры остается не более 50 ед/mr стрептокиназы (около 1-2Ъ), менее

20 ед/мл .стрептодорназы (около 2Ъ); менее 1 ТЕ/мл гиалуронатлиазы (1Ъ) и менее 20 МЕ/мл стрептолизина (около ОЪ). После выделения кокков активность стрептокийазы

80-85Ъ, активность стрептодорназы65Ъ, активность гиалуронатлиазы и стрептолиэина - 4ОЪ.

После хроматографической очистки на колонне активность,Ъ« стрептокиназы 60, стрептодорназы 25, гиалуронатлиазы 20, стрептолиэина

15.

Удельная активность составляет

40000 и 50000 МЕ/Мг для стрептокиназы, 2500 — 5000 .МЕ/мг у стрептолизина О, 400 ТЕ/мг гиалуронатлиа» зы и 8000-10000 ед. у стрептодорназы.

Пример 2. 5 л стрептококковой культуры обрабатывают согласно примеру 1. После вымывания продуктов стрептококкового обмена из погибших кокков получают 500 мл раствора в 0,1 М растворе Фосфатного буфера. Этот раствор перемешивают с 15 г двуокиси кремния в течение

2 ч при комнатной температуре.

Стрептолиэин О,. стрептодорнаэа и стрептокиназа адсорбируются, тогда как гиалуройатлиаэа остается в растворе и после осаждения 300 х сульфата аммония может быть очищена следующим образом.

Оставляют на ночь и отделяют на центрифуге. Растворяют в 10 мл воды и центрифугируют до прозрачного раствора. Затем удаляют сульфат диалиэом относительно 0,02 М раст-. вора фосфатного буфера и наносят согласно примеру 1, на колонку

2,5„ 25 см, наполненную ДЭАЭ-агароэой и хроматографируют. Стрептолиэин, стрептодорнаэу и стрептокиназу, адсорбированные на двуокиси кремния, выделяют перемешиванием B течение

20 мин в воде с рН 9,5-10,5 и очищают согласно примеру 4, гиалуронатлиазу получают с активностью 1200 ТЕ/мг.

Пример 3. Отделение гиалуронатлиазы от других продуктов обмена веществ иэ сырого фильтрата культуры осуществляют с помощью

2Î двуокиси кремния. К 5 л отцентрифугированной стрептококковой культуры перемешивают 15 г высокодисперсной двуокиси кремния с рН 7,5 в течение 2 ч. Стрептолизин, стрептодорназа или стрептокиназа, адсорбированные на двуокиси кремния, могут быть очищены согласно примеру

4. Гиалуронатлиазу после осаждения сульфатом аммония очнщают согласно примеру 2. Получают стрептокиназу с активностью 60000-80000 ед/мг и стрептодорназу с активностью 1000020000 ед/мг.

Пример 4. Сырой концентрат. выделяют согласно примеру 1 иэ 5 л стрептококковой культуры вымыванием погибших кокков 0,1 М раствором фосфатного буфера (рн 8,0) дважды по 250 мл. Затем. 450 мл раствора центрифугируют до прозрачного, дово40 дят рН до 3,5 и осаждают продукт добавкой 45 г НаСР. После 30 мин разделения на центрифуге осадок растворяют в 100 мл воды с добавлением 1 н.раствора NaOH по каплям.

Нерастворимый осадок отбрасывают.

К этому раствору добавляют 10 мл

0,5 N раствора Ма НРО и доводят рН до 6,9. При перемешивании и поддержании постоянного рН добавкой 1 н. раствора NaOH продукт осаждают добавлением по каплям 5,0 мл 1 М раст,вора СаСВ . Перемешивают. 15 мин и в течение 45 мин отделяют центрифугированием. Кальцийфосфатный осадок промывают 50 мл 0,02 М раствором фосфатного буфера (рН 8,0). Затем

140 мл объединенного раствора насыщают 38 мл сульфата аммония.

Перемешивают 15 мин и дают 45 мин отстояться, а затем отделяют осадок фО центрифугированием, Осадок промывают 50 мл 22Ъ-ным раствором сульфата аммония и выбрасывают. Центрифугат и промывную воду объединяют, получают 175 мл. Иэ 5 этого раствора отделяют стрептокиназу

840100 формула изобретения (5

25

40

Составитель С. Малютина

Редактор О. Черниченко ТехредЖ.Кастелевич КорректорС. щомак

Эакаэ 4663/32 Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по. делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.р д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. ужгород, ул. Проектная, 4 осаждаением при рН 7,0 и добавлением

45Ъ-ного сульфата аммония от большей части стрептодорназы. Для этого контролируют рН и добавляют еще 77 мл насыщенного раствора сульфата аммония. После 15 мин перемешивания и

45 мин отстаивания осадок отделяют центрифугированием, промывают 50 мл

50%-ным раствором сульфата аммония и затем растворяют в 20 мл воды.

Этот раствор подвергают диализу относительно 0,02 М раствора фос- Ц) фатного буфера с рН 8,0 и наносят аналогичным образом на подготовленную колонку согласно примеру 1.

Элюируют аналогично, Получают примерно 50% исходного количества стрептокиназы. Из остатка осаждения содержащего 60% стрептодорназы, последнюю можно легко выделить, осаждая добавлением 20 r твердого сульфата аммония на:100 мл раствора (47 г на 235 мл) . После 30 мин перемешивания и 60 мин отстаивания осадок отделяют на центрифуге.

Стрептодорназу растворяют в

0,02 M растворе фосфатного буфера (20 мл), подвергают диализу относительно того же буфера и наносят на колонку, наполненную ДЭАЭ-агарозой.

Элюируют также с линейным градиентом между 0,02 раствором фосфата (pH 8,0) и 0,02 М фосфатом +0,4 N

NaCB (рН 7,6) . При применении штамма стрептококка получают три активные фракции, которые элюируют при концентрации поваренной соли около 0,02, 0,05 и 0,5 Я, Последняя фракция содержит 90% всей активности стрептодорназы. Выход составляет

20%.

Активность очищенной стрептокиназы составляет 60000-80000 ед/мг.

Предлагаемый способ позволяет выделить в едином технологическом -. процессе несколько продуктов обмена из культуры стрептококка С, используемых в -медицине.

1. Способ выделения стрептолизина

О, гиалуронатлиазы, стрептодорназы и стрептокиназы, заключающийся в том, что культуральную жидкость.

Я содержащую стрептококки, подкисляют до рН 3,0-4,0, осаждают стрептококки с адсорбированным на них целевым продуктом, далее целевой продукт элюируют 0,1 M раствором фосфатного буфера при рН 7,5-9,5, затем осаждают его из элюата раствором сернокислого аммония, повторно элюируют

0,02 М раствором фосфатного буфера, полученный элюат хроматографируют на ДЭАЭ-агарозе и выделяют-целевой продукт элюацией в линейном градиенте, 2; Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью выделегия гиалуронатлиазы, полученный после злюирования 0,1 M раствором фосфатного буфера элюат разбавляют фосфатным буфером рН 6,0-7,0 в соотношении 1:1, добавляют двуокись ,кремния и перемешивают при рН 6,07,0, выпавший осадок отделяют, а нз надосадочной жидкости. осаждают целевой продукт сернокислым аммойием, осадок растворяют, диализуют против

О,02 М раствора фосфатного буфера и полученный диализат хроматографирунт на ДЭАЭ-агарозе °

3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем; что, с целью выделе- ния стрептокиназы и стрептодорназы, к полученному после элюирования 0,1

l1 раствором фосфатного буфера элюату добавляют 10%-ный раствор хлористого натрия, выпавший осадок растворяют, обрабатывают раствор фосфорнокислым кальцием и выделяют целевой продукт осаждением сернокислым аммонием и хроматографией на ДЭАЭ-агарозе.