Способ индикации внутриклеточноговируса

Способ индикации внутриклеточноговируса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(ii)840102

ОП ИСАНИЕ

ИЗО6РЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Соцкапнсткческих

Республик (61) Дополннтельное к авт. свнд-ву— (22)Запвлено05.12.78 (21) 2716312/28-13 с присоединением заявки М (23)Прнорнтет — .

Опублнковано 23.06.81. Бюллетень .% 23 (5! )М. Кд

С 12 К 7/00

Тесударстеенеый камитет

СССР пс делам езе4ретеннй и етхрытвй (5З) УД 576.858 (088.8) Дата опубликования опнсамия 23.06.81 (72) Авторы изобретения

М. Б. Королев, Т. А. Иванникова.и В.;М.: -Лисак=-. -;1 . Э

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов .. :

Академии медицинских наук СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО

ВИРУСА

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии.

Известен способ индикации внутрикпеточного вируса с помощью иммуно« электронной микроскопии, заключающийся в получении комплексов аггрегированных иммунной сывороткой вирусных частиц с последующей их визуализацией в электронном микроскопе (l ).

Известен также способ индикации внутриклеточного вируса путем разрушения вируссодержащих клеток или кусочков органного материала замораживанием и оттаиванием (2).

Однако известный способ является трудоемким и не обеспечивает высокой чувствительности.

Цель изобретения — повьппение чувст вительности и упрощение способа.

Эта цель достигается тем, что перед замораживанием клетки или кусочки ор ганного материала ресуспендируют в иммунной сыворотке.

Способ осуществляется следующим образом.

Клетки культуры ткани механически отделяют от стекла и вместе с куль туральной жидкостью центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5-10 мин, Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1-2 капли иммунной сыворотки, в которой ресуснендируют осажденные клетки. Каплю полученной взвеси переносят на металлическую пластинку и подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию попеременным с мещением пластинки на поверхность суxoro льда и ладони руки.

Каплю взвеси ресуспендированных в сыворотке и лизироватпых в результате замораживания и оттаивания клеток помещают на предметное стекло и инкубируют в течение 15-30 мин во влажной камере (чащка Петри со смоченной водой фильтровальной бумагой). Затем на каплю накладывают предметные сетки, спустя 1-3 мин, ополаскивают их дистил.

840 з лированной водой (в целях удаления несвяэавшейся сыворотки) и подвергают не гативному контрастированию.

При необходимости выявления и идентификации вирусов в тканях и органах небольшие кусочки (около 1 мм ) пос 1 ледних помещают на металлическую пластинку, подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию, добавляют 1-2 капли разведенной антисыворотки, ресуспендируют в ней лизированную ткань концом пастеровской пипетки, снова подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и далее обрабатывают так же, как клетки культуры ткани.

Пример 1 . Выявление и идентификация вируса Синдбис в культуре клеток почек китайского хомяка.

Вирус Синдбис обычным образом выращивают в культуре клеток почек китайс. кого хомяка в 100 мл флаконах при о

37 С. Исходный титр вируса, используем ого для заражения, составляет

5-15 БОЕ/мл. Спустя 24 ч после заражения клетки механически снимают со стекла и центрифугируют вместе с культуральной жидкостью в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, ее следы удаляют фильтровальной бумагой. К клеточному осадку до-, бавляют 1-2 капли иммунной сыворотки в разведении 1:10 и ресуспендируют в ней клетки концом пастеровской пипетки. Каплю полученной взвеси переносят на металлическую пластинку диаметром

1-3 см и подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию попеременным помещением пластинки на поверхность сухого льда и ладони руки. После этого каплю взвеси лизированных в результате замораживания и оттаивания и ресуспендированных в сыворотке клеток помещают на предметное стекло и инкубируют в течение 15-30 мин во влажной камере (чашка Петри со смоченной водой фильтровальной бумагой). Затем на каплю накладывают предметные сетки, покрытые формваром и углеродом спустя 1-3 мин ополаскивают их дистиллированной водой и наносят каплю фосфорновольфрамовой кислоты с рН 6,5, избыток которой удаляют краем фильтровальной бумаги. После этого сетки просматривают в электронном микроскопе при увеличении 4000050000. Выявляют одиночные или аггрегированные вирусные частицы покрытые ареолом антител сыворотки. Контролем специфичности реакции служат клетки ресуспендированные в дистиллированной .

102

40

55

45 воде, нормальной или гетерологичцой сыворотке.

Пример 2 . Выявление и идентификация вируса клещевого энцефалита в культуре клеток почек эмбриона свиньи.

Вирус клещевого энцефалита (штамм

718) выращивают обычным образом в пробирочной культуре клеток почек эмбриона свиньи. На 2-ые сутки после заражения клеточный монослой механически снимают со стекла пробирки и далее обрабатывают согласно примеру 1, за исключением того, что иммунная сыворотка используется в разведении 1:4.

При электронномикроскопическом изучении в препаратах выявляют аггрегаты полных и пустых вирусных частиц.

Пример 3 . Выявление и идентификация вируса Западного Нила в культуре клеток комаров Aedes aepчр13.

Культуру клеток комаров А aegyptл выращивают в 50 мл флаконах на обогащенной среде С-45 с 10% нормальной тео лячьей сыворотки и инкубируют при 26 С

После сформирования монослоя клетки заражают вируссодержащей суспензией мозга новорожденных белых мышей с титром .вируса 7,5-8,0 2 3 50 мл.

После адсорбции вируса его удаляют из флаконов, клетки промывают ростовой средой, добавляют среду С-45 с 5% нормальной телячьей сыворотки. Перевивки зараженной культуры проводят каждые 5-6 сут. После трех субкультивирований зараженные культуры помещают в условия субоптимальной температуры о (10-20 С) на 30 сут, меняя затем температурный режим на оптимальный (26 С). Для анализа берут материал на третьи сутки после заражения, на

30 сут инкубации при субоптимальной температуре и на первом пассаже после изменения температурного режима на оптимальный. Обработку материала ведут согласно примеру 1. Иммунную сыворотку используют в разведении l:5. В препаратах выявляют агрегаты покрытых, антителами вирусных частиц.

Пример 4 . Выявление и идентификация вируса Западного Нила в мозгу новорожденных белых мышей. Для заражения используют слив культуральной жидкости с культуры клеток комаров

А. аЕgðрО, хронически инфицированной вирусом Западного Нила, 0 03 мл культуральной жидкости вводят в мозг новорожденных белых мышей. На 3 сут после заражения мышей забивают, выделяют небольшие кусочки (около 1 мм ) чения в электронном микроскопе через

30-50 мин после взятия материала, что в 3-5 раз быстрее способа иммунноэлектронномикроскопического выявления вирусов с использованием высокоскоростного центрифугирования.

Способ не требует использования какого-либо специального оборудования или реактивов и может быть осуществлен на базе любой электронномикроскопической лаборатории.

Предлагаемый способ является специфичным, так как аггрегация вирусных частиц имеет место лишь при использо1 5 вании го м ОлОГичнОй и м мунной сывОрОтки и отсутствует при ресуспендировании клеток и тканей в дистиллированной воде, нормальной или гетерологичной сывороч ке.

Способ индикации внутриклеточного вируса путем разрушения вируссодержаг5 ших клеток или кусочков Органного материала замораживанием и оттаиванием, отличающийсятем,что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, перед замораживани50 ем клетки или кусочки органного материала ресуспенпируют в иммунной сыворотке

Источники информации, чринятые во внимание при экспертизе

1.Doane T. æ JdeetHicut оХч1гоьеч Ьч бтиюоиоеСect on л сгîscoр 4нгаС тиеопойад noss s, Асад. Рге% дпс- Ие,Э-Лот М 6914,р.237-15 Ь.

2. Практическая вирусология. Под ред. Сюрина В. Н., М., Колос 1970, с. 90-91.

Составитель С. Малютина

Редактор О. Черниченко Техред Н.Ковалева

Корректор H. Степ

Подписное

Заказ 4664/33 Тираж 528

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, -35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Унгерна, ул.,Пролетали, 4

840 102 коры головного мозга, помещают их на металлическую пластинку и подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию. Затем на кусочки ткани наносят каплю неразведенной иммунной сыворотки, ресуспендируют в ней частично лизирован . ную ткань концом пастеровской пипетки, снова подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и далее обрабатывают согласно примеру l. При просмотре препаратов в электронном микроскопе выявляют аггрегированные сывороткой скопления вирусных частиц. Контролем специфичности реакции служат кусочки мозговой ткани ресуспендированной в иммунной сыворотке против вируса клещевого энцефалита.

Пример 5 . Выявление и индентификация вирусов, изолированного из москитов РИЕЬОЬоvnue ьР. го

Вирусом, изолированных из москитов р еЬо оЮОВ % заражают интрацеребраль» но новорожденных белых мышей. На 3сут после заражения при проявлении выраженных клинических признаков заболевания мышей забивают, выделяют кусочки коры головного мозга, которые обрабатывают согласно примеру 4. В качестве иммунной сыворотки используют асцитную жидкость иммуннизированных вирусом белых мышей. При просмотре препаратов в электронном микроскопе выявляют аггрегированные сывороткой частицы, характерные для группы рабдовирусов.

Предлагаемый способ позволяет проводить в отличии от существующих, выявление и идентификацию внутриклеточного вируса как в клетках тканевых культур различного происхождения, так и в тканях органов зараженных животных.

Способ является быстрым, так как препараты готовы для просмотра и изуФор мула изобретения