Способ бактериологической диагностикивоспалительно- нагноительных заболеванийлегких

Способ бактериологической диагностикивоспалительно- нагноительных заболеванийлегких

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

« 843955

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕ Н И Я

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Ю (б1) Дополнительное и авт. свпд-ву (22) Заявлено 11.07.79 (21) 2790558 28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07,07.81. Бюллетень № 25 (45) Дата опубликования описания 07.07.81 (51) М. К .""

А 61 В 10/00

Государственный комитет по делам изобретений и открытий (53) УДК 616-07 (088.8) ( (72) Авторы изобретения 1О. А. Муромский, Д. А. Егоркина и К. И. Савицкая (71) Заявитель Московский областной ордена Трудового Красного

Знамени научно-исследовательскчй клинический институт им. М. Ф. Владимирского (54) СПОСОБ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ

ДИАГНОСТИКИ ВСПОМОГАТЕЛЬНОНАГ НО ИТЕЛ ЬН Ь1Х ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ

2 осущсствляют следующим об

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии.

Известен способ бактериологической диагностики воспалительно-нагноительных заболеваний легких путем посева исследуемого материала на питательную среду с последующим выделением чистых культур микроорганизмов и определением их биохимических свойств (1).

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности.

Целью изобретения является повышение точности диагностики.

Эта цель достигается тем, что способ бактериологической диагностики воспалительно-нагноительных заболеваний легких осуществляют путем посева исследуемого материала на питательную среду с последующим выделением чистых культур микроорганизмов и определением биохимических свойств, у выделенных культур микроорганизмов определяют наличие лецитиназы и фосфотазы, пересевают их:a первичную однослойную культуру ткани пери" ферических участков неизменного легкого и по наличию цитотоксического эффекта в

54,2 — 83% клеток диагносцируют воспалительно-нагноительное заболевание легких.

Способ разом.

Исследуемый материал (мокрота, содержимое плевральной полости, кусочки легкого, полученные при операции) высевают в чашку Петри с 5%-ным кровяным агаром, средой Эндо и Плоскирева. Через

18 ч инкубации в термостате при 37"С снимают по 8 — 10 однотипных колоний кульIp тур микроорганизмов, определяют лецитиназную и фосфотазную активности. Суспендируют чистые культуры в 1 мл 0,15 М раствора ХаС1 (рН 7,2 — 7,4) . Суспензия культур, обладающих указанными видами

15 активности, доводят 0,15 М NaC! по стандарту мутности до концентрации IO - кл/мл и добавляют к монослою первичной культуры ткани периферических участков неизменненного легкого.

Однослойную культуру первично дезагрегированных клеток ткани периферических участков неизмененного легкого получают следующим образом.

В асептических условиях тщательно ос вобождают ткань от крови, полостного содержимого альвеол, бронхиол, готовят оптимально действующую дсзагрегп1зующую смесь веществ, разрушающую только ме>кклеточные связи. Затем приготавливают зп питательную смесь для обработки ткани и

843955

3 культивирования клеток оптимального состава.

Процесс обработки ткани и культивирования сводится к следующему, Щадяще удаляют висцеральный листок плевры. Отрезают относительно большие участки периферических отделов ткани ле|кого (4,0Х4,0Х1,0 дм), пригодныс для культивирования. Эти кусочки разрезают на более мелкие (0,5>< 1,0 дм) в чашке

Петри с теплой (37 С) питательнои смесью, содержащей среду 199 — 48 /о, гидролизат лактальбумина 47, сыворотку крупного рогатого скота 5О/о, стрептомицин хлор-кальциевый комплекс 300 †5 ед/мл.

Кусочки последовательно промываюг в четырех сменах вышеназванной питательной смеси. С использованием лупы удаляют стенки сосудов н бронхиол так, чтобы не повредить клетки и мембраны альвеол, содержимое альвсолярных полостей выжимают, кусочки отмывают последовательно в четырех сменах питательной смеси вышеназванного состава, но не содержащей стрептомицина, Отжатые от питательной смеси кусочки ткани помещают в инактивированную при 56 С в течение 30 мин сыворотку здоровых доноров АВ (IV) группы. Промытые в сыворотке в ечение

10 мин кусочки переносят в сухую чашку

Петри, в которой ткань измельчают до размера 0,5 — 1,0 мм и помещают в коническую колбу на 500 мл с 300 мл дезагрегирующей смеси, состоящей из следующих компонентов, " : 0,257о-ный раствор трипсина 86, 0,02 /о-ный раствор версена 10, сыворотка человека АВ (IV) группы (инактивирована при 56 С в течение 30 мнн) 4.

Кусочки ткани дсзагрегируют на магнитной мешалке при 37 С в темноте в течение одного-двух часов. Суспензию клеток профильтровывают через однослойный марлевый фильтр и центрифугируют в микробиологических пробирках при 800 об/мин в течение 10 мин.

Насадочную жидкость сливают, осадок щадяще ресуспендируют в питательной смеси, приготовленной для культивирования и состоящей из следующих компонентов, /o. среда Игла 10, среда 199, 30, гидрализат лактальбумина 30 с сывороткой крупного рогатого скота 2, сыворотка человека (получена от здоровых доноров АВ (IV) группы, резус — положительная, инактивирована при 56 С в течение 30 мин) 20, раствор глютамина в среде 199, добавленного из расчета 500 мкг/мл питательной смеси, и вновь цснтрифугируют при указанном режиме.

Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в необходимом объеме вышеназванной питательной смеси для культивирования, суспензию профильтровывают через двуслойный марлевый фильтр. Проводят подсчет содержания эпи5 0

Зо

05 ()0

4 тслиоподобных клеток в 1 мл приготовленной суспензии в камере Горяева с использованием лейкоцитарного меланжера и

3 /,-ного раствора уксусной кислоты с мстилсновым синим. Këåòêè подсчитывают полностью в двух-четырех сетках камеры с вычислением содержания среднего количества клеток в одной сетке и с соответствующим пересчетом на l мл, как ри подсчете лейкоцитов. Рабочую концентрацию клеток доводят до 2)<10 клеток в 1 мл.

Готовую суспензию клеток разливают 00

1 мл в микробиологические пробирки равного размера (длиной 15 см, диаметром

l,3 см) без IIOI

I1åðåä закрыванием пробирок рези овыми пробками, в случае необходимости, поверхность суспензии продувают либо газовой смесью с 5 СО>, либо последними порциями выдыхаемого воздуха до получения рН питательной смеси, равной 6,8. Культивирование проводят при 37 С в термостате с водяной рубашкой до получения монослоя клеток (14 — 21 — 28 суток), Процесс формирования монослоя культуры ткани первично дезагрегированных клеток периферических участков легкого состоит из нескольких этапов, Смену питательной смеси проводят через 3 — 5 — 7 дней, в зависимости от изменения рН, Объем полученной суспензии клеток и количество пробирок с одинаковым монослоем клеток к моменту инкубации определяется количеством исследованных штаммов стафилококков.

По сформировании монослоя клеток (7 — 14 — 21 — 28 сутки) в пробирки с культурой добавляют суспензию микроорганизмов в концентрации 10 микробных тел в l мл 0,15 М раствора NaC1 (рН 7,2 — 7,4), по 1 мл в каждую пробирку, в контрольныс пробирки по 1 мл 0,15 М раствора NaC1 с предварительным сливом 1 мл питательной смеси.

Спустя один час инкубации добавляют но 1 мл питательной среды Игла без слива суспензии стафилококков и физиологического раствора из контрольных пробирок.

Спустя шесть часов инкубации содержимое пз пробирок сличают (процедура проведена в термостате), осторожно наливают 3 мл 0,25О/о -ного раствора трипсина, подогретого до 37 С, который через минуту удаляют и добавляют новую порцию трипсина но 0,2 мл, с которым культуры инкубируют в термостате при периодическом встряхивании до отделения клеток от

843955 (аблипа

Фсрмснтьп характсризу)ощие штамм № штамма

Вид стафнлококка г о

62

28 () 35 S. aureus

128/53 S. cpidermidis ! 06/3! S. epidermidis

82/i . epidermidis

17 S. aureus

Контроль

Заказ 4460

Изд ¹ 418

Тираж 094

Подписнос

Загорская типография Упрполнграфнздата Мособлисполкома

11р и и е и а н и е: + наличие <1)ермента — отсутствие фермента стенок пробирок и полной дезагрегации нх.

К полученным в пробирках суспензиям клеток прп комнатной температуре добавляют по 1,8 мл смеси витальных красите лей, состоящей из 0,1 /с-ного раствора трипанового синего в дистиллированнои воде и 0,1%-ного раствора эозина в растворе

Эрла двухкратной концентрации.

Краситель смешивают перед употреблением в соотношении 1: 1. Взвеси клеток с красителем тщательно суспепдируют пипеткой Пастера, отдельной для каждои пробирки и с одинаковым сечением. Капл)о суспензии вносят в камеру Горяева. Прово. дят подсчет неспособных клеток в первые минуты после добавления смеси красителей полностью в двух-четырех сетках камеры из каждой пробирки под малым увеличением микроскопа.

П р и м с р. Больной Л. В культуре взята ткань неизмененных периферических участков рсзерцированного во время операции правого легкого бледно-розового цвета, наполненная пенистым содержимым. Тщательно и щадяще обрабатывают в теплой питательной смеси с антибиотиками и без антибиотиков, в сыворотк человека АВ (IV) группы, удаляют стенки сосудов, бронхиол, дезагрегируют клетки ткани в течение 1,5 ч, отмывают от дезагрегирующей смеси, получают рабочую суспензию клеток с содержанием 2Х10 клеток в 1 мл, разливают суспензию по 1 мл в 30 пробирок без покровных стекол, в 30 — с покровными стеклами, в 4 флакона Карреля.

1-Iа 16 сутки культивирования добавляют I)o 1 мл суспензии штаммов стафилококков, суспендированных в физиологическом растворе в концентрации 10 микробных тел после предварительного удаления из пробирок с культурами по 1 мл питательной смеси. Спустя один час инкубации

6 добавляют по 1 мл питательной среды Игла и продол>ка)от инкубацию в течение шести часов.

Для подсчета с витальными красителями в камере Горяева для каждого штамма выделяют по 3 — 4 пробирки без покровных стекол, а для цитоморфологических исследований — со стеклами.

Рас)пифровывают шта м мы после оконча10 ния подсчета. Отмечают наиболее высокий цитотоксический эффект штамма прп статически достоверном различии с контролем, характеризующегося наличием гемолпзина, лецитиназы и фосфотазы (10+ 2,52 при р(!

5 0,0005), а также штамма, характеризующегося наличием только лецитиназы (12+-3,76 при р (0,0005) при показателях контроля

32 )- 4,97) .

Прп исследовании фиксированных жидкостью Карнуа либо метанолом клеток культур после инкубации со стафилококками и окрашенных азур-эозином, гематоксилпп-эозином, по Граму отмечают деструктивные изменения с сильно выраженной вакуолпзацией эндоплазии, разрушением цитоплазматической и ядерной мембраны, с образованием гранул пигмента, пикнозом

)1 )gP 11 ЛИЗПСОМ KJICTOK.

Предложенный способ позволяет установить новый этиопатогенетический фактор воспалительно-нагноптельных заболеваний легких и тем самым повысить качество диагностики заболевания, в частности, деструктивных процессов в легки.;..

Формула изобретения

Способ бактериологической диагностики воспалительно-нагноительных заболева40 ппй легких путем посеза исследуемого материала на питательную среду с последующим выделением чистых культур микроорганизмов и определением биохимических свойств, отличающийся тем, что, с

45 целью повышения точности диагностики, у выделенных культур микроорганизмов определяют наличие лецитиназы и фосфотазы, пересева)от их на первичную однослойную культуру ткани периферических участков неизмененного легкого и по наличию цитотоксического эффекта в 54,2 — 83% клеток диагносциру)от воспалительпо-нагноитсльное заболевание легких.

55 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Руководство по микробиологической диагностике инфекционнь)х болезней, Под ред. К. И. Матвеева, М., «Медицина >, 1973, с. 332 — 338.