Способ определения гистамина в би-ологическом материале

Способ определения гистамина в би-ологическом материале

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советсннх

Соцналнстнчесннх

Республнн

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 25.07.79 (21) 2832576/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М К

G 01 N 33/52

Гооударетееииык комитет йо делам изооретеиий и открытий

Опубликовано 07.07.81. Бюллетень №25

Дата опубликования описания 17.07.81 (53) УДК 615.787 (088.8) (72) Авторы изобретения

В. Н. Соминский и В. А. Кузнецова

Рижский медицинский институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТАМИНА

В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения гистамина.

Гистамин является одним из важнейших гуморальных биологических регуляторов — тканевых гормонов. Его непосредственное участие в процессах микроциркуляции и в аллергических реакциях обуславливает необходимость определения количества этого вещества- в различных экспериментальных условиях и при клинической диагностике.

Известен способ определения гистамина в биологическом материале (1), который осуществляется следующим образом.

Из депротеинизированного образца . готовят две аликвоты, содержащие гистамин, для опытной и холостой проб. К 1 мл опытной пробы прибавляют последовательно 0,2 мл 1 н.раствора едкого натра; 0,15 мл

0,2%-ного раствора ортофталевого альдегида в метаноле и 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты. К 1 мл холостой пробы прибавляют те же реактивы, но в обратном порядке — 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты, 0,15 мл 0,2%-ного раствора ортофталевого альдегида в метаноле и

АНИЕ 1

0,2 мл 1 н. раствора едкого натра. Такой порядок прибавления реактивов в холостой пробе объясняется стремлением создатусловия, при которых не будет происходить образование флуоресцирующего продукта конденсации гистамина и ортофталевого альдегида. Далее, из величины флуоресценции опытной пробы вычитают величину флуоресценции холостой пробы и полученный результат используют для определения по калиоровочному графику концентрации гистамина в образце. Изменение данного (обратного) порядка внесения реактивов в опытную и холостую пробы невозможно, так как не позволяет учесть интенсивность флуоресценции реактивов и исключает про-. ведение исследования.

При определении флуоресценции калибровочных растворов стандартов гистамина в концентрации 0,1 мкг/мл получают 100ед. флуоресценции, для 0,002 мкг/мл — 3 сд. флуоресценции.

График, построенный по этим и иромет жуточным значениям, проходит через ось ординат на уровне 1 — 3 единиц шкалы.

Следовательно, ошибка определения концентрации гистамина в биологическом ма845099 меряют флуоресценцию опытной и контрольной проб с помощью спектрофлуориметра при длине волны возбуждения 360+.2,86 нм и длине волны флуоресценции 440+-2,86 нм.

По разнице флуоресценции опытной и контрольной проб определяют концентрацию гистамина в образце с помощью калибровочного графика.

При апробации данного способа проведено 51 экспериментальное исследование по определению флуоресценции калибровоч10 ных растворов стандартов гистамина в концентрации 0,002 — 0,5 мкг/мл в образцах крови морских свинок. Ошибка определения составила 2 /о. При этом значение флуоресценции холостых проб отличалось хорошей воспроизводимостью — процент расхождения параллельных проб 15 — 17О/,.

Проведено 71 клиническое исследование гистамина в образцах крови здоровых лиц и больных различными заболеваниями, при этом проводили сравнение двух методик (прототип и данный способ) с характеристикой их ошибки. Ошибка определения содержания гистамина в биологическом материале, проведенного по прототипу в сравнении с предлагаемым способом, составила 25-30/

Приведенные данные показывают, что предлагаемый способ определения гистамина в биологическом материале ввиду высокой точности и простоты выполнения может быть широко применен в практике биохимических исследований в клинике.

Формула изобретения териале может равняться 50 — 60 /о. Раз брос величин обусловлен непостоянством случайным характером значений флуорес ценции холостых проб.

Выполнение анализов большого коли чества образцов добавлением реактивов в двух взаимно противоположных последо вательностях снижает точность исследова ния и в значительной степени затрудняет ра боту.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения гистамина в биологическом материале путем последо вательного добавления к нему едкого нат ра, раствора ортофталевого альдегида в ме таноле и соляной кислоты, измерен14я флуо ресценции пробы и сравнения полученных данных с контролем, к контрольной пробе предварительно добавляют 0,05 — 0,07 мл

33о/о-ного раствора перекиси водорода.

Способ осуществляется следующим образом.

4 мл крови собирают при температуре +4 С в полиэтиленовую пробирку, содержащую 1 мл О,бо/о-ного раствора двунатриевой соли ЭДТА и 35 мг аскорбиновой кислоты. Добавляют 5 мл охлажденного 1м раствора хлорной кислоты с аскорбиновой кислотой (7 мг/мл). Интенсивно встряхивают. Смесь центрифугируют при температуре +4 С при 2000о, в течение 30 мии.

К полученному супернатанту прибавляют

0,25 мл 5 и едкого натра; 1,5 г хлористого натрия и 10 мл н-бутанола. Раствор встряхивают 5 мин и центрифугируют при 500й в течение 3 мин. Бутанольную фазу с экстрагированным гистамином переносят в пробирку с 3 мл 0,1 н раствора соляной, кисло- 35 ты и 8 мл гептана. Смесь встряхивают 5 мин.

Центрифугируют при 500а в течение 3 мин.

К мл кислотной фазы, содержащей гистамин (опытная проба), добавляют 0,2 мл Ь4 раствора едкого натра и 0,15 мл 0,2о/и-ного раствора ортофталевого альдегида в ме- 40 таноле. Через 4 мин добавляют 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты. К 1 мл кислотной фазы, содержащей гистамины (контрольная проба), добавляют 0,06 мл 33о/р-ного раствора перекиси водорода и перемеши- 45 вают раствор. Затем прибавляют 0,2 мл 1 н, раствора едкого натра, 0,15 мл 0,2п/р-ного раствора ортофталевого альдегида в метаноле и 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты. Не позднее, чем через 30 мин, изСпособ определения гистамина в биологическом материале путем последовательного добавления к нему едкого натра, раствора ортофталевого альдегида в метаноле и соляной кислоты, измерения флуоресценции пробы и сравнения полученных данных с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, к контрольной пробе предварительно добавляют 0,05 — 0,07 мл 33о/о-ного раствора псрекиси водорода.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. P.À. Shore. Fhe Chemical Determination of Aistamine t7letheds of Biochemica)

analysis. Analysis of Biogenic amines and

fheis Related Enzymes Sypplement. 1го!игпе, Jnterscience Publish., 1971, р. 89 — 97.

Составитель О. Ленчицкая

Редактор Н. Потапова Тех ред А. 5о и кас Корректор Г. Назарова

Заказ 4136/2 Тираж 907 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4