Способ получения гетерогенных биокатализаторов

Способ получения гетерогенных биокатализаторов

Реферат

 

(19)RU(11)845476(13)C(51)  МПК ⁶    _C12N11/02Статус: по данным на 17.12.2012 - прекратил действиеПошлина:

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения гетерогенных биокатализаторов ферментов, иммобилизованных в нерастворимых матрицах, которые могут найти широкое применение в химической, пищевой, медицинской и микробиологической промышленностях. Наиболее близким к способу, описанному в предлагаемом изобретении, является способ, заключающийся в том, что фермент включают в структуру полимерного материала формованием из прядильного раствора, полученного эмульгированием водного раствора фермента в растворе полимера в несмешивающемся с водой органическом раcтворителе c поcледующим образованием в водной фазе эмульcии пространственно-структуpированного полимера, включающего фермент, и превращение эмульсии в суспензию. Для этого в водный раствор фермента перед эмульгированием вводят по крайней мере один водорастворимый мономер, способный образовывать пространственно-структурированный полимер, и компонент инициирующей полимеризацию системы, затем после образования эмульсии добавляют второй компонент инициирующей полимеризацию системы, а после полимеризации мономеров в водной фазе превращения эмульсии в суспензию формуют полимерный материал. При иммобилизации по этому методу ферментов с мол.м. менее 100 тыс. в водный раствор фермента дополнительно к мономеру и компоненту инициирующей полимеризацию системы вводят полифункциональный сшивающий реагент, способный реагировать с функциональными группами макромолекулы фермента и пространственно-структурированного полимера. Полифункциональный сшивающий реагент может быть введен в готовую эмульсию водного раствора фермента в растворе полимера и несмешивающемся с водой органическом растворителе. В прядильном растворе, содержащем набухший в воде пространственно-структурированный полимер, включающий фермент, невозможен переход эмульсии типа "вода в масле" в эмульсию типа "масло в воде". Благодаря этому становится возможным повышение концентрации волокно- или пленкообразующего полимера в прядильном растворе как путем отгонки из раствора части органического растворителя, так и путем смешения его с более концентрированным раствором полимера. Возможно также формование полимерного материала непосредственно из полученного прядильного раствора. В способе-прототипе волокна формуют по сухому или мокрому способу, а пленки по сухому способу. Указанный способ-прототип позволяет получать гетерогенные биокатализаторы, содержащие необратимо связанные ферменты. Эффективность иммобилизации ферментов при этом способе составляет для уреазы 23,7% (при активности иммобилизованной уреазы 9 тыс. ед/г), для пенициллинамидазы от 19,2 до 56% (при активности иммобилизованной пенициллинамидазы до 30 тыс. ед/г), для трипсина 14% Недостатком указанного способа получения гетерогенных биокатализаторов, содержащих необратимо связанные ферменты, является сложность процесса. Эта сложность заключается в том, что в водный раствор фермента и в эмульсию водного раствора фермента в растворе полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе приходится вводить много реагентов, необходимых для получения включающего фермент пространственно-структурированного полимера (мономер или смесь мономеров, два компонента инициирующей полимеризацию системы, полифункциональный сшивающий реагент), а процесс является многостадийным. Учитывая, что ферменты являются крайне лабильными веществами, необходимость использования большого числа реагентов и многостадийность процесса существенно затрудняет процесс получения гетерогенного биокатализатора высокого качества. Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности иммобилизации и ферментативной активности иммобилизованного фермента при уменьшении числа реагентов, необходимых для образования пространственно-структурированного полимера, включающего фермент. Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения гетерогенных катализаторов, включающем эмульгирование водного раствора фермента в растворе пленкообразующего полимера и несмешивающемся с водой органическом растворителе, образование в водной фазе эмульсии пространственно-структурированного полимера, включающего фермент, и формование пленки и волокна, в раствор фермента или в водную фазу эмульсии вводят полифункциональный сшивающий агент, и образование пространственно-структурированного полимера проводят сшивкой фермента в растворе полимера. В водный раствор фермента может быть введен водорастворимый полимер. Полимерный материал формуют непосредственно из полученного прядильного раствора или увеличивают в нем концентрацию волокно- или пленкообразующего полимера путем отгонки из раствора части органического растворителя, смешения его с более концентрированными раствором полимера или растворения дополнительного количества полимера. П р и м е р 1. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 150 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют 55 мл охлажденного до 0^оС раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере, рН7,5 (ферментативная активность 40000 ед/мл, содержащие белка 160 мг/мл) и эмульгируют в течение 20 мин при 20^оС при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 14 мг 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют в тех же условиях еще 15 мин. Из указанного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и хранят в 0,066М фосфатном буфере (рН7,5, 4^оС). Ферментативная активность (за 1 единицу активности пенициллинамидазы принято количество фермента, которое образует 1 мк-моль 6-аминопенициллановой кислоты при гидролизе 0,016М раствора бензилпенициллина в 0,066М фосфатном буфере, рН 7,5 при 411^оС в течение 1 ч) полученной пленки 52800 ед/г сухой пленки и эффективность иммобилизации 50,9% (отношение активности иммобилизованного фермента к активности фермента, введенного в прядильный раствор). П р и м е р 2. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 250 мл метиленхлорида добавляют 40 мл охлажденного до 0^оС раствора пенициллинацилазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5 (ферментативная активность 40000 ед/мл, содержание белка 160 мг/мл) и эмульгируют при перемешивании мешалкой (700 об/мин) в течение 20 мин при 20^оС. К полученной эмульсии приливают 8 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют в тех же условиях еще 15 мин. Из полученной суспензии ферментного препарата в растворе триацетата целлюлозы в метиленхлориде путем продувания воздуха над перемешивающейся суспензией отгоняют часть метиленхлорида до концентрации триацетата целлюлозы в растворе 6% Из полученного прядильного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер. Ферментативная активность полученного препарата и эффективность иммобилизации равны соответственно 39000 ед/г сухой пленки и 45,0% П р и м е р 3 (сравнительный по прототипу). Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 4 г триацетата целлюлозы в 100 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют охлажденный до 0^оС раствор, представляющий собой смесь: 40 мл раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5% (ферментативная активность 21500, содержание белка 82 мг/мл), 4 мл раствора в воде смеси акриламида и метилендиакриламида (весовое соотношение мономеров 9: 1, концентрация в растворе 500 мг/мл), 2 мл 25% водного раствора персульфата аммония и проводят эмульгирование при 20^оС в течение 20 мин при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 8 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют еще 15 мин. Затем добавляют 1,0 мл N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамина и перемешивают 10 мин при 20^оС (50 об/мин). В результате полимеризации акриламила и метилендиакриламида в водной фазе происходит образование полиакриламидного геля, в структуру которого были включены макромолекулы пенициллинамидазы. К полученной суспензии ферментного препарата в растворе триацетата целлюлозы в метиленхлориде добавляют 6 г триацетата целлюлозы и растворяют 2 ч при 20^оС. Из указанного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер (рН 7,5, 4^оС). Ферментативная активность полученного препарата 11640 ед/г сухой пленки, эффективность иммобилизации 22,5% П р и м е р 4. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 4 г триацетата целлюлозы в 100 мл метиленхлорида добавляют 40 мл охлажденного до 0^оС раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5 (ферментативная активность 21500 ед/мл, содержание белка 82 мг/мл) и эмульгируют при 20^оС при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 12 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют 15 мин при 20^оС. Затем в полученную эмульсию вводят концентрированный раствор 6 г триацетата целлюлозы в метиленхлориде и перемешивают в течение одного часа при 20^оС. Из указанного прядильного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и хранят в 0,066М фосфатном буфере (рН 7,5, 4^оС). Ферментативная активность полученного препарата равна 12060 ед/г сухой пленки и эффективность иммобилизации 22,6% Таким образом, при том же, что и в сравнительном примере 3, способе приготовления прядильного раствора активность полученного гетерогенного биокатализатора и эффективность иммобилизации близки к соответствующим характеристикам катализатора, полученного в примере 4 прототипа. П р и м е р 5. К раствору 10 г полиарилата Ф-1 в 150 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют 55 мл охлажденного до 0^оС раствора пенициллинамидазы в 0,3М фосфатном буфере рН 7,5, ферментативная активность 40000 ед/мл, содержание белка 160 мг/мл, и эмульгируют в течение 20 мин при 20^оС при перемешивании мешалкой (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 14 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют в тех же условиях еще 15 мин. Из указанного прядильного раствора формуют пленку по сухому способу. Пленку промывают водой, 1М раствором хлористого натрия, водой и помещают на хранение в 0,066М фосфатный буфер (рН 7,5, 4^оС). Ферментативная активность полученной пленки 60000 ед/г сухой пленки и эффективность иммобилизации 57,9% П р и м е р 6. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 40 г триацетата целлюлозы в 320 мл метиленхлорида добавляют 60 мл раствора уреазы в 0,1М фосфатном буфере рН 7,0; содержание белка 81,5 мг/мл, ферментативная активность 47700 ед/мл (за одну единицу активности уреазы принято количество фермента, которое образует 1 мк-моль аммиачного азота при гидролизе 2% раствора мочевины в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,0) и эмульгируют 20 мин при механическом перемешивании (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 1,5 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют еще 15 мин при 700 об/мин. Полученный раствор выдерживают при 20^оС в течение 1 ч и используют для формования волокна по мокрому способу в осадительную ванну толуол метиленхлорид 89 11 (объемные). Полученное волокно сушат от органических растворителей 2 ч на воздухе и хранят под 0,1М фосфатным буфером рН 7,0 при 4^оС. Ферментативная активность полученного препарата 31400 ед/г сухого волокна, эффективность иммобилизации 53% П р и м е р 7. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 2 г триацетата целлюлозы в 100 мл метиленхлорида добавляют смесь 40 мл раствора уреазы в 0,3М фосфатном буфере (ферментативная активность 39500 ед/мл, содержание белка 115 мг/мл) и эмульгируют 20 мин при механическом перемешивании (700 об/мин). К полученной эмульсии добавляют 2 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и эмульгируют еще 15 мин, затем добавляют 8 г триацетата целлюлозы и перемешивают (50 об/мин) до полного растворения около 2 ч. Из полученного прядильного раствора формуют пленки по сухому способу при 20^оС. Ферментативная активность полученного препарата 22560 ед/г сухой пленки, эффективность иммобилизации 20,9% П р и м е р 8. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 20 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл) и 1,6 мл 2,5% водного раствора глутарового альдегида. Эмульгирование проводят при 20^оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 9% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20^оС. Пленку формуют по сухому способу. Далее пленку промывают 1М раствором NaCl, содержащим НСl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают и сушат. Эффективность иммобилизации 20% П р и м е р 9. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 10 мл полиакриламида (200 мг/мл), 0,4 мл 2,5% водного раствора глутарового альдегида и 10 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл). Эмульгирование проводят при 20^оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 9% и выдерживают прядильный раствор в течение часа при 20^оС. Пленку формуют по сухому способу. Далее пленку промывают 1М раствором NaCl, содержащим HCl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации 14% П р и м е р 10. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 10 г триацета целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 10 мл полиэтиленимина (250 мг/мл), 0,4 мл 2,5% водного раствора глутарового альдегида и 10 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл). Эмульгирование проводят при 20^оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 9% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20^оС. Пленку формуют по сухому способу. Далее пленку промывают 1М раствором NaCl, содержащим НСl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации 14% П р и м е р 11. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 20 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 5 мг/мл) и 1,6 мл 2,5% водного раствора ди-4,4'-(4''-6''-дихлор-S-триазинил)-аминостильбен-2,2'-ди- сульфокислоты. Эмульгирование проводят при 20^оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 5% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20^оС. Пленки формуют по сухому способу. Далее пленки промывают 1М раствором NaCl, содержащим НСl (pH 3) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации 27% П р и м е р 12. Прядильный раствор получают по следующей методике. К раствору 10 г триацетата целлюлозы в 256 мл метиленхлорида при комнатной температуре добавляют смесь 10 мл раствора трипсина в 0,3М фосфатном буфере рН 7,0 (концентрация фермента 10 мг/мл), 10 мл водного раствора полиэтиленимина с концентрацией 250 мг/мл и 1,6 мл 2,5% водного раствора ди-4,4'-(4''-6''-дихлор-S-триазинил)-аминостильбен-2-2'-дисульфокислоты. Эмульгирование проводят при 20^оС 20 мин при механическом перемешивании (600 об/мин). Из полученного раствора отгоняют часть метиленхлорида путем продувания воздуха над перемешивающимся раствором до концентрации триацетата целлюлозы в метиленхлориде 5% и выдерживают прядильный раствор в течение 1 ч при 20^оС. Пленки формуют по сухому способу. Далее пленки промывают 1М раствором NaCl, содержащим HCl (рН 3,0) при многократной смене промывного раствора, затем промывают водой и сушат. Эффективность иммобилизации 20% Таким образом, предложенный способ позволяет существенно повысить эффективность иммобилизации и ферментативную активность иммобилизованного фермента по сравнению с соответствующими характеристиками гетерогенных биокатализаторов, полученных по способу-прототипу. Например, при иммобилизации трипсина по способу-прототипу эффективность иммобилизации составляет 14% а по предлагаемому способу до 27% При иммобилизации пенициллинамидазы по предлагаемому способу получают гетерогенные биокатализаторы с активностью до 60 тыс. ед/г (при эффективности иммобилизации 57,9%), в то время как по прототипу получают катализаторы с активностью до 30 тыс. ед/г (эффективность иммобилизации 41%). При иммобилизации уреазы по способу-прототипу получен катализатор с активностью 800 ед. (при эффективности иммобилизации 2,1%), а по заявляемому способу катализатор с активностью до 31,4 тыс.ед. (при эффективности иммобилизации 53%).

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ, включающий эмульгирование водного раствора фермента в растворе пленкообразующего полимера в несмешивающемся с водой органическом растворителе, образование в водной фазе эмульсии пространственно-структурированного полимера, включающего фермент, формование пленки и волокна, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности иммобилизации и ферментативной активности иммобилизованного фермента, в раствор фермента или в водную фазу эмульсии вводят полифункциональный сшивающий агент, и образование пространственно-структурированного полимера проводят сшивкой фермента в растворе полимера. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в водный раствор фермента вводят водорастворимый полимер.