Способ получения пептидов

Способ получения пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕ Н ИЯ

И ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 170778 (21) 2639399/23-04 (23) Приоритет — (32) 18.07.77

Союз Советских

Соцмалмстичесеа

Ресттублик

<>}}84577 (51) М. Кл.

С 07 С 103/5

//А 61 К 37!

Рвуддретввнный квмнтет

СССР

40 делам нзобретеннй н открыткой (331 ВНР (31) R1-640

Опубликовано 070781. Бюллетень ¹ 25

Дата опубликования описания 090781 (53) УДК 547.96 .4.07(088.

Иностранцы

Лайош Кишфалуди, Дьердь Ньеки, Ласло Сирмаи, 1гон.-Карпат

Каталин Гидаи и Ласло Спорни 1 (ВНР) (72) Авторы изобретения

Иностранное предприятие

"Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр PT" (ВНР) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ е, каИзобретение относится к способу получения новых пептидов — биологичес ки активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Способ наращивания пептидной цепи методом активированных эфиров, например пентафторфениловых эфиров, широко известен в химии пептидов (1) .

Цель изобретения — получение новых пептидов, обладающих ценными фармако- .1О логическими свойствами.

Поставленная цель достигается описываемым способом получения пептидов общей формулы I

Х-Arg-Ча1-Tyr-11еи-Н } s-Pro-У 15 где Х вЂ” остаток алифатической карбоновай кислоты, содержащей в ОС-положении аминооксиацетильную или c} аминооксипропильную группу; 20

Y — Leu, I leu, заключающийся в том, что реакционноспособное производное обшей формулы II

Н-Arg(A)-Val-Туг(В)-1Ieu-His(E)-Pro

-Y-0G 25 где А — тозил;

 — бензил;

Š— динитрофенил;

G — водород или и-нитробензил;

Y имеет значения, указанные в подвергают взаимодействию с реакц онноспособным производным аминоок карбоновой кислоты общей формулы I

W-X-М где Х вЂ” имеет значения, указанные выше;

W — бензилоксикарбонильная ил трет-бутилоксикарбонильна группа;

N — пентафторфенокси, и от полученного соединения общей формулы IV

W-X-Arg(A)-Ча!-Туг(В)-Ileu-His(E)

;-Pro-Y-0G, где А,В,Е,G,W,5(и Y имеют значени указанные выше, отщепляют одновременно или ступен то защитные группы. Используемые в честве исходных веществ производи t гептапептидов общей формулы ll no

8457

10 ют известными методами пептидной химии (например, методом активированных эфиров, карбодиими!дным методом и т.п. P2))

Для защиты функциональных групп применяют защитные группы, стабильные в условиях ацидолиза, проводимого для отщепления защитных групп после завершения реакции образования пептидной связи.

Предпочтительным для временной защиты карбоксильной группы С-концевой аминокислоты является ислользование п-нитробензильной группы (ЙВ), для защиты гидроксильной группы тирозина — бензильной группы (Bzf), для защиты имидазольного цикла гист щйна — динитрофенильной группы (0NPh) и для защиты гуанидино-группы аргинина — тозильной группы (Tos). Эти защитные группы устойчивы к действию 20 слабых кислот, вследствие чего трет-бутилоксикарбонильная группа (ВОС) отщепляется после образования пептидной связи селективно без затрагивания названных защитных групп. Динитрофениль-25 ная группа может быть удалена затем тиолиэом, а остальные указанные группы — действием жидкого фтористого водорода.

Для очистки полученных соединений 30 используют известные методы, например ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе. При этом большую часть продуктов получают в виде лиофилизованнйх порошков. Такие продукты 35 могут быть использованы непосредственна для образования различных солей или комплексов.

Антагонистическое действие новых соединений общей формулы исследуют 40 на животных после введения им наркотика. 1(ровяное давление измеряют на сонной артерии животного. Эксперименты проводят таким образом, что вызывают повышение давления введением наркоти- 45 ка в вену бедра в дозе 0,5 мг/кг/мин.

После стабилизации повышения давления животному вводят внутривенно или подкожно однократную дозу исследуемого вещества в водном физиологическом 50 растворе, затем измеряют вызванное введенным веществом уменьшение кровяного давления.

Достигнутые величины уменьшения кровяного давления при внутривенном 55

73 4 введении различных новых соединений приведены в табл. 1. Эти величины являются средними из шести измерений, указаны также предельные отклонения от средних значений. Для сравнения приведены величины, достигнутые с помощью известного саралазина, т.е. †(й-метилглицин)-5-L-валин-8-L-алании-ангиотензина 1!, в тех же условиях.

Таблиц а 1

L (1-Аминооксиацетил,8-лейцин)-ан.гиотензин I!

-33+3, 6 -42+4, 2 (1-О-ah-аминооксипропионил, 8-лейцин)-ангиотензин !!

-30+3,4 -38 3,8 (1-Аминооксиацетил, 8-изолейцин)-ангиотензин !! †28,0 -40-5,7 — 41+ 2,5

Саралазин

Иэ данных, приведенных в табл. 1, следует, что все аналоги ангиотензина rr, замещенные в первом положении алифатическим остатком карбоновой кислоты, содержащим 0(-аминооксигруппу, существенно снижают кровяное давление.

Размер этого действия пропорционален величине дозы.

Проведено также исследование новых соединений при подкожном введении. В этом случае:к физиологическому раствору поваренной соли, содержащему исследуемое вещество, добавляют также карбокаиметилцеллюлозу или желатин.

В табл. 2 приведены ббобщенные результаты исследований — средние значения измерений, йроведенные у пяти животных, а также величины предельных отклонений от средних значений.

845773

Таблица 2

Добавка к

Снижение кровяного давления

Доза, мг/кг в мм вт.ст.) по истечении мин

1Соединение раст— вору

КМЦ" -21+5,8 -26+7,2 -13 9,4 -5

Жлт ® -23 2,0 -21+ 2, 2 — 10+2, 8 —,1

К11Ц -21+6,7 -24+5,7 -164 5,1 — 1 (1-D-ob-аминоокси200 пропионил, 8-лейцин)-ангиотензин 11

200

Жлт -24+5,7 -21+ 5,6 -9+5,7 -3

Х

КМЦ вЂ” карбок симе тилцеллюлоз а

ХХ

Жлт — желатин.

Результаты, приведенные в табл.2, свидетельствуют о том, что новые соединения при подкожном введении, даже через 60 мин, значительно снижают экспериментально вызванное повышение кровяного давления.

Благодаря таким свойствам предлагаемые соединения, а также их физиологически совместимые соли и комплексы могут найти применение в терапии как средства, понижающие кровяное давление. Под физиологически совместимыми комплексами этих новых пептидов следует понимать такие соединения, ко тбрые образуются при добавлении известных, например, органических веществ и придают действующему началу запаздывающее действие. В качестве таких комплексообразующих веществ могут быть использованы, например, желатин,карбоксиметилцеллюлоза,сложные

40 эфиры альгиновой кислоты, полифлоретинфосфаты,полиаминокислоты,а также другие полимеры и сополимеры. В качестве физиологически совместимых

45 солеи новых пептидов могут быть названы обычные, используемые в фармацевтической практике соли, образоранные присоединением кислот, например ацетаты.

Новые пептиды, а также их физиоло,гически совМестимые соли и комплексы используют в терапии в виде обычных лекарственных препаратов. Эти препараты содержат новые соединения

55 вместе с пригодными для энтерального и парэнтерального введения неорганическими или органическими носителями.

Лекарственные препараты могут быть тов;

Й не ее ов нные ль-. ид моов, овылегносци денами,. ояслое" испреto/ (1-Аминооксиацетил, 200

8-лейцин)-ангиотензин 11 200 получены в виде твердых лиофилиз в этом случае в качестве носител могут быть использованы различны реагирующие с пептидами соединен такие, например, как углеводы. Д в качестве лекарственных препара могут быть получены концентриров или разбавленные суспензии или э сии, которые наряду с обычными кими носителями содержат также с билизирующие и консервирующие вс могательные вещества.

Такие лекарственные препараты гут быть использованы прежде все в терапии для лечения тех синдро в этиологии которых йграет роль шенный за счет ренина уровень да ния; далее, они могут служить ди тическими средствами для диффере рованной диагностики гипертонии нального происхождения.

Получение новых пептидов обще формулы I проиллюстрировано прив ными ниже примерами. Использован

I в примерах сокращения соответств принятым в специальной литератур

Принадлежащиесб-аминооксикислот группы обозначают обычными симво соответствующих аминокислот со с щими перед ними О", например "О

II лиц — аминооксиуксусная кислота

"Оал" -Ф -амииооксипропионовая к та и т.д. Пентафторфенильный ост ток — ПФФ.

При получении различных соеди ний упаривание растворителей про водят всегда с помощью роторного парителя. Температуры плавления деляют с помощью аппарата Dr. To

7 8457 (Blichu). Тонкослойную хроматографию проводят на пластинах "Kieselgål G

nach Stahl" (E.Herck. 0armstadt); для проявления хроматограмм используют следующие системы растворителей:

1. Этилацетат: (пиридин-уксусная кислота-вода 20:6:11) = 95:5

2. Этилацетат: (пиридин-уксусная кислота — вода 20:6:II) 90:10

3. Этилацетат: (пиридин-уксусная 1О кислота — вода 20:6:11) = 80:30 .

4. Этилацетат. (пиридин-уксусная кислота — вода 20:6:11) = 70:30

5. н-Бутанол : уксусная кислота : вода = 4:1:.5 15

6. н-Бутанол: уксусная кислота:

:пиридин : вода = 30:6:20 24 !

7. н-Бутанол : этилацетат : уксусная кислота : вода = 1:I:1:l

Пифра в степени при значении Ру 2о указывает номер использованной системы растворителей, например Р

Ъ

Электрофоретические исследования на бумаге проводят на горизонтальном приборе "LNIM" умеренного напряжения на бумаге "HN 214" в буферном растворе при рН 1,9, содержащем глутаминовую кислоту. Напряжение составляет

450 в, время — 3 ч..

Тонкослойные хроматограммы проявляют нингидрином после обычного хлорирования раствором о-толидина с йодистым калием.

Очистку целевых продуктов проводят следующим общим методом. 35

Сначала соли свободных пептидов с фтористым водородом чистят на смоле

"SephacryI S"200 Superfine" (произВорсТВа Pharmacia Fine chemicals, Uppsala, Schweden) градиентной элю- 4О цией 0,01 М (рН 4,5) и 0,4 М (рн 6,7) растворами ацетата аммония. Детектирование элюата производят с помощью прибора "LKB Uvicord I(" (производст8a LKB, Uppsala, Швеция), сбор — с по-45 мощью коллектора фракций.

Дальнейшую очистку основной фракции проводят иа карбоксиметилцеллюлозе следующим образом.

0,5 л карбоксиметилцеллюлозы

50 (К Ш-52) приводят в состояние равно.весия в колонке с первым буферным раствором, затем в колонку заливают раствор 0,5 r пептида в 4 мл 0,01 М раствора ацетата аммония и вымывают продукт градиентной элюцией укаэанными буферными растворами. Скорость элюировання 25 мл/ч. Собирают фракции

73 8 по 10 мл и детектируют их с помощью прибора LKB Uvicord !1. Очищенный целевой продукт получают лиофнлизацией основной фракции.

Пример !. (1-Амннооксиацетил, 8-изолейцин)-ангиотензин 11

Стадия 1: ВОС - Arg (Tos) - Val

-Туг (Bzl) - Еle - His (DNPh) — Pro

«I I e - NB.

К 4,5 г (15 ммоль) хлоргидрата нитробензилового эфира изолейцина в 50 мл хлороформа добавляют 2,1 мл триэтиламина и 3,81 r (10 ммоль) пентафторфенилового эфира БОК-пролина. Смесь перемешивают 20 мин при комнатной температуре, продукт экстрагируют водой, затем 10Х.-ным водным раствором лимонной кислоты. Полученный после высушивания и упаривания растворителя в виде остатка защищенный дипептид (R = 0,8) растворяют с ) без дополнительной очистки в 20 мл

8 M раствора соляной кислоты в диоксане. Через 10 мин раствор разбавляют безводным эфиром и упаривают.

Полученный в остатке хлоргидрат дипептида (R = 0,44) растворяют в

30 мл хлороформа, добавляют к раствору триэтиламин до рН 8 и затем—

8,8 г (15 ммоль) пентафторфенилового эфира ВОС-гистидина. Через 1,5 ч в раствор вносят 1,65 мл N,N-диметиламиноэтиламина и еще через 15 мин раствор промывают 1ОХ-ным водным раствором лимонной кислоты, 1 н. соляной кислотой, водой и 57.-ным водным раствором бикарбоната натрия в указанной последовательности. Органическую фазу отделяют, высушивают и упаривают. Полученный в виде остатка сырой защищенный трипептид (Ру = 0,50) без очистки растворяют в 20 мл 8 M раствора соляной кислоты в диоксане. Через

15 мнн полученный таким образом свободный трипептид (R<1. = 0,25) осаждают добавлением сухого эфира, отфильтровывают и промывают эфиром, Продукт тотчас же растворяют в смеси 50 мл хлороформа с 20 мл диметилформамида, величину рН раствора с помощью триэтиламина устанавливают равной 8 и затем добавляют 6,0 г (15 ммоль) пентафторфенилового эфира ВОС-изолейцина. Через 30 мин растворитель упаривают, остаток растворяют в этилацетате. Полученный раствор промывают 10 -ным водным раствором лимонной кислоты и затем водой. После

84577 ом

У п. астодоига сты3 и ез ° высушивания и упаривания этилацетатного раствора защищенный гексапептид (R< 0,56) выделяют с помощью эфи(Я.) ра и промывают эфиром.

Далее продукт растворяют в 20 мп

8 М. раствора соляной кислоты в диоксаие и полученный таким образом свободный гексапептид (Rg = 0,47) осажда!

41 ют сухим эфиром, отфильтровывают и промывают эфиром. Полученный продукт !О тотчас растворяют в 50 мл диметилформамида, добавляют триэтиламин до рН 8, после чего прибавляют 7,2 r (12 ммоль) пентафторфенилового эфира

ВОС-аргинина (Tos). Смесь перемешива- I5 ют 1 ч, растворитель упаривают, остаток растворяют в хлороформе и полуенный раствор промывают IÎX-ныи водным раствором лимонной кислоты, н. раствором соляной кислоты и водой в 20 указанной последовательности. Органическую фазу отделяют, высушивают и упаривают,остаток растирают с эфиром и отфильтровывают. Получают 12,4 г защищенного гептапептида нитробензило-25 вого эфира ВОС вЂ” Arg (Tos) - Val

-Tyr(Bzl) - IIe - His(DNPh) - Pro -IIe (выход 807 от теоретического, в расчете на исходное соединение — пентафторфениловый эфир BOC-пролина). З0

Т.пл. 189-192оС. Ry = 0,55.

Стадия 2: ВОС-Оглиц- Arg (Tos)

Va l - Tyr - lIe — His — Pro - 1!е.

8,1 г (2 ммоль) нитробенэилового з5 эфира ВОС-Arg(Tos) -Va 1-Tyr(Bzl) -J Iå.H!s(DNPh)-Рго-11е растворяют в 5 мл диметилформамида и в раствор добавляют 2,9 мп 2-меркаптоэтанола. Через

1 ч пептид осаждают сухим эфиром, от- 40 фильтровывают, проьывают эфиром и очищают переосаждением эфиром из метанола. Получают 2,0 г (747 от теории) нитробензилового эфира ВОСАгс!(Tos)-Ча1-Tyr(Вг1)-1!eu-His-Ве, (Rg = 0,1). Продукт растворяют в

30 мл смеси метанол-уксусная кислота — вода 5:1:I и добавляют 1,0 r

1ОХ-ного палладия на активированном угле. Через раствор в течение 5 часов 50 .пропускают водород, затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают и остаток растирают с эфиром. ПолучаtoT I,22 г (757 от теоретического) частично защищенного гептапептида 55 (R = 0,8). Продукт растворяют (5) в 5 мл 8 M раствора соляной кислоты в диоксане и через 20 мин сухим эфи3 IO ром осаждают свободнйй гептапептид (R 4> =-О, !).

Свободный гептапептид отфипьтро вают, промывают эфиром и растворяю. в 15 мп диметилформамида. Величину рН раствора с помощью триэтиламина устанавливают равной 8 и к раствор добавляют 0,45 г (1,2 ммоль) пента фторфенилового эфира BOC Оглицина.

Через 30 мин реакционную смесь упа вают, остаток растворяют в 30 мл с си хлороформ-диметилформамид (3:1) и раствор промывают IOX-ным раство лимонной кислоты и водой. После вы шивания и упаривания раствора полу ют остаток, который растирают с 9Т ацетатом, отфильтровывают и промыв ют этилацетатом. Получают 0,4б г

BOC-Оглиц-Arg(Тоз)-Val-Tyr-3 lе-Hiз

Pro-IIe (выход .72Ж от теоретическо го); R = 0,23; R I ) = 0,40.

Стадия 3: .удаление защитных rp

0,46 г (0,35 ммоль) ВОС-ОглицArg(Tos).-Va1-Tyr-Iiе-His-Pio-Ilå воряют в 2 мл жидкого фтористого в рода и добавляют к раствору 0 5 тиоанизола. Раствор выдерживают 1 при ООС, затем осаждают пептид эф ром; отфильтровывают и прОмывают э ром. Получают 0,35 г (выход IOOX o теоретического) (1"аминооксиацетил

8-11е)-ангиотензина !1 фторгидрат

Продукт очищают, как описано выше (до примеров). Характеристика чист продукта:

Р 0,26; RI = 0,56; 1

= 0,57; ЕОР 1,00.

Результаты аминокислотного анал за: Pro 1,01 (1) 1 Va 1 1,0 (1); 11е

l,98 (2); Tyr.О,á5 (1); His 1,0 (1 (Arg 1,03 (1).

Пример 2. (1-1-О -аминоок пропионип, 8-изолейцин)-ангиотензи

Стадия 1: ВОС-OAla-Arg (Tos) -Ча1

«Туг-Ile-His-Pro-Ile.

0,6 r (0,5 ммоль) ВОС-Arg- (Tos)

Ча1-Tyr-Ilå-His-Pro-1le (пример 1, стадия 2) растворяют в 5 мп 8 М р вора соляной кислоты в диоксане. рез 20 мин полученный свободный п тид (R$ = 0,1) осаждают сухим ром, отфильтровывают и промывают. деленный таким образом продукт то час растворяют в 20 мл диметилфор да, добавляю триэтиламин до рН 8 затем 0,7 г (1,9 ммоль) пентафтор фенилового эфира ВОС-Оаланина. Че

30 мин раствор упаривают, остаток

ll 8457 растворяют в 30 мл смеси хлороформдиметилформамид (3;i). Полученный раствор промывают 10 -ным водным раствором лимонной кислоты и водой. Органическую фазу высушивают, упаривают и остаток растирают с этилацетатом.

Получают 0,55 r (выход 84 от теоретического) 80С"Ола-Arg(Tos)-Чаl Tór«(1е Н!з РГ0116.

R = 0,43; Rg = 0,80. (к), (5)

Стадия 2: удаление защитных групп.

0,53 г (0,42 ммоль) ВОС-ОАlа-,, -Arg(Tos)-Va 1"Туг -11е"His-Pro-(1е растворяют в 2 мл жидкого фтористого водорода и добавляют. 0,55 мл тиоанизола.

Раствор выдерживают 1 ч при ОоС, затем осаждают пептйд сухим эфиром, отфильтровывают и промывают эфиром.

Получают 0,41-г (1-0аланин, 8-изолейцин)-ангиотензина il продукт очи- ур щают, как описано вьпле. R = 0,32; (62

К =058; R! =059; Eg =1,0.

Результаты аминокислотного анализа: Pro 1,0 (1); Va) 1,1 (1); Ile

2,02 (2); His 0,9 (1); Tyr 0,95 (1); л

Агд 1,05 (1).

Пример 3. (1-Аминооксиацетил; 8-лейцин}- ангиотензин !!.

Стадия 1: BOG-Arg(Tos) -Val-Tyr(Bz1)-Ile-His-Pro-Leu ОНБ. зр

4,2 r (12 ммоль) бромгидрата нитро.бензилового эфира лейцина растворяют. :в 50 мл хлороформа и к полученному раствору добавляют 1,68 мп триэтиламина и 3,81 г (10 ммоль) пента- з5 фторйенилового эфира ВОС-пролина.

Смесь перемешивают 20 мин при комнатной температуре и затем экстрагируют

1О -ным водным раствором лимонной кислоты и водой. Органическую фазу высу- 4Р шивают и упаривают. Полученный в ос(<2 татке защищенный дипептид (R

= 0,8) без дополнительной очйстки растворяют в 20 мл 8 М раствора соля— ной кислоты в диоксане, через 10 мин 4 раствор разбавляют сухим диоксаном и упаривают.

Полученный в остатке свободный дипептид (RJ = 0,56) без дополнитель.ной очистки растворяют в 50 мл хлоро- 5Р форма, в раствор добавляют тризтиламин до рН 8 и затем 8,8 r (15 ммоль} пентафторфенилового эфира ВОС"гистидина (DNPh). Через 30 мин в раствор добавляют 1,65 мл N,N-диметиламиноэтил- >5 амина и еще через 10 мин смесь промы— вают 10%-ным водным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной

12 кислоты, водным раствором бикарбоната натрия и водой в укаэанной последовательности.

Органическую фазу высушивают и упаривают, полученный в виде остатка защищенный трипептид (R< = 0,65) (<2 без дополнительной очистки растворяют в 25 мл 8 M раствора соляной кислоты в диоксане и полученный свободный трипептид (R = 0,47) осаждают сухим (4) эфиром. Трипептид отфильтровывают, Ь промывают эфиром и тотчас растворяют в смеси 50 мл хлороформа с 20 мл диметилформамида. В раствор добавляют триэтиламин до рН 8 и 6,0 г (15 ммоль) пентафторфенилового эфира ВОС-изолейцина. Через 30 мин растворитель упаривают, остаток растворяют в этилацетате, раствор промывают 10 -ным водным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной кислоты и водой, органическую фазу высушивают и упаривают.

Полученный в остатке защищенный тетрапептид (R< = 0,65) высаживают

Ю () с помощью смеси н-гексан-эфир (7:3).

Продукт растворяют в 25 мл 8 М раствора соляной кислоты в диоксане че(4 рез 15 мин свободный пептид (R<

0,65) осаждают сухим эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром и сразу же растворяют в 50 мл смеси хлороформ-диметилформамид (1:1). Величину рН раствора устанавливают равной 8 с помощью триэтиламина и добав- . ляют в раствор 6,0 г (11,5 ммоль) пентафторфенилового эфира ВОС-титрозина. Через 15 мин растворитель упаивают, остаток растворяют в этилаце-. ате,к раствору добавляют 0,66 мл

Й,((-диметиламиноэтиламина и через

15 мин смесь промывают 10 -ным водным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной кислоты и, наконец, водой. После высушивания и упаривания органической фазы с помощью эфира вы(Ъ) деляют защищенный пентапептид (R<

0,8) и растворяют его в 20 мл 8 M раствора соляной кислоты в диоксане.

Полученный свободный пентапептид (Ry = 0,8) осаждают сухим эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром и тотчас растворяют в 50 мл диметилформамида. Величину рН раствора с помощью триэтиламина устанавливают равной 8 и добавляют в раствор 3,85 г (10 ммоль) пентафторфенилового эфира

ВОС-валина. Через 1 ч отгоняют раст13

845773

14 ор стдоют

П. створитель, остаток растворяют в хлороформе, органическую фазу обычным образом экстрагируют IОХ-ным водным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной кислоты.и водой.

Полученный защищенный гексапептид .(R = 0,82} выделяют с помощью эфира. Продукт растворяют в 20 мл 8 М раствора соляной кислоты в диоксане и через 15 мин сухим эфиром осаждают !О свободный гексапептид (К = 0,55). ь

Свободный гексапептид сразу же растворяют в 40 мл диметилформамида, добавляют триэтиламин до рН 8 и 6,0 г (10 ммоль) пентафторфенилового эфира

BOG-аргинина (Tos). Через 30 мин отгоняют растворитель, остаток растворяют в хлороформе и этот раствор промыва1от 1 н. раствором соляной кислоты и водой. После высушивания и упаривания 20 растворителя с помощью этанола выделяют полученный защищенный гептапептид ВОС-Arg (Тоз) -Va l -Tyr (Bz l ) -I I eHis(DNPh)-Pro-Leu-0NB (R+ = 0,62).

Выход 7,5 г (50X от теоретического zs в расчете на исходное соединение— пентафторфениловый эфир ВОС-Pro).

Т.пл. 186-190 С.

Стадия 2: ВОС-Оглиц-Arg(Tos)-Val

-Туг-Ile-His-Pro-Leu 3,45 г 30 (2,26 ммоль) ВОС-Arg (Tos) -Ча1-Tyr (Bz 1 ) -. ale" Hi s (DNPh) -Pro-Leu-ON B растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют 6,6 мл 2-меркаптоэтанола и через 2 ч сухим эфиром осаждают частично защищенный гептапептид. Переосаждением эфиром из метанола получают 2,9 r очищенного нитробензилового эфира ВОС-Arg(Tos) -Val-Tyr(Bzl) -Ile-H!s-Pro-Leu (93X от теории). . 40

Rg = 0,12; R) = 0,26. й) . ъ1

Продукт растворяют в смеси метанол-уксусная кислота — вода (5: 1: 1), добавляют 1,0 r IOX-ного палладия на активированном угле и в течение 6 ч 45 (! т через раствор пропускают водород. 1 а-- ализатор отфильтровывают, растворитель упаривают и остаток растирают с эфиром. Получают 2,15 r (89X от теоретического) ВОС-Arg(Tos)-Val Òóã- 50

11е-His-Pro-Leu.

Rg = 0,75; R< = 0,20.

З1 . ()

1,1 r (1 ммоль) полученного продукта растворяют в 10 мл 8 М раствора соляной кислоты в диоксане, через 55

30 мин свободный гептапептид (R (4

= 0,08) осаждают сухим эфиром, отфильтровывают, промывают эфиром и сразу же растворяют и 10 мл димет формамида. В раствор добавляют три этиламин до рН 8 и затем 0,54 г (1,5 ммоль) пентафторфенилового эф ра -ВОК-Оглицина. Через 30 мин раст разбавляют 30 мл хлороформа и про вают водой. После высушивания и уп ривания раствора остаток растирают с этилацетатом,. отфильтровывают и промывают этилацетатом. Получают !,05 r (выход 86Х от теоретическог

BOC-Оглиц-Arg(Tos)-Val-Tyr-Ile-His

° Рго-Leu.

Стадия 3: удалейие защитных гру

0,9 г (0,73 ммоль) ВОС-Оглиц-.

Arg(Tos) -Val Òóã-lIe-H1s-Pro-Leu p воряют в 5 мл жидкого фтооистого в рода и добавляют 1,5 мл тиоаниэол

Смесь выдерживают 1,5 ч при О С, з тем осаждают пептид сухим эфиром, отфильтровывают его и промывают эф ром . Получают 0,55 r (выход 80Х от теоретического) (1-Оглицин; 8-лейцин)-ангиотензина II. Продукт очищ ют как описано выше. и 5! = 0,33;

Rg = 0,60; R = 0,55; Eg 1 (ь5 . р!

Результаты аминокислотного акал за:-Pro 1,0 (1); Val 1,0 (1); Ile

I,0 (I); Leu !,1 (1); His 0,95 (I)

Arg 1,0 (1); Tyr 0,7 (1).

Пример 4. (1-Q -Аминоокс пропионил; 8-лейцин)-ангиотензин

Стадия 1: ВОС-ООА1а-Arg(Tos)-Va

° Гуг-IIe-His-Pro-Leu.

1,1 r (1 ммоль) ВОС-Arg(Tos)-Va

Туг-Ile-His-Pro-Leu растворяют в

10 мл 8 N раствора соляной кислоты в диоксане и через 30 мин свобод пептид осаждают сухим эфиром, осад отфильтровывают и промывают эфиром

Продукт немедленно растворяют в 10 диметилформамида, в раствор добавл триэтиламин до рН 8 и затем 0,56 r (1,5 ммоль) пентафторфенилового эф

ВОС-О-Оаланина. Через 30 мин раств разбавляют хлороформом и промывают водой. После высушивания и упарива растворителя остаток растирают с этилацетатом, отфильтровывают и пр мывают этилацетатом. Получают 0,95 (выход 77Х от теоретического) ВОС° ОА1 а-Arg(Tos) -Val Tór-31e-Hi s-Pro.1.еи; В! = 0,29.

Стадия 2:,удаление защитных гру

0,95 г (0,77 ммоль) ВОС-О-OAlaArg(Tos}-Va1 Òóã-31е-His-Pro-Leu p воряют в 4 мл жидкого фтористого в

Формула изобретения

25

15 8457 рода и добавляют 1,2 мл тиоаниэола.

Раствор выдерживают 1,5 ч при 0 С, затем продукт осаждают сухим эфиром, отфильтровывают и промывают эфиром.

Получают 0,6 г (I--0-Оаланин; 8-лейцин)-ангиотензина ll (выход 907 от ! теоретического), который очищают, как

;описано вьппе, (71

В 0,33; R = 0,61;

R g О, 56; Eggu = 1, 10. 10

Результаты аминокислотного анализа:

Pro 1,02 (1); Чаl 1,0 (1); Leu 1,02 (1); Х1е 1,03 (1); His 1,01 (1);

Arg 0,92 (1); Туг 0,8 (1).

Способ получения пептидов общей формулы 1

X-Arg-Чаl-Tyr- 1eu-His-Pro-Y где X — - остаток алнфатической карбоновой кислоты, содержащей в ñ6-положении аминооксиацетильную илиЖ -аминооксипропильную группу;

Y — Leu, IIеи, отличающийся тем, что реакционноспособное производное общей формулы Ii

Н-Arg(А)-Val-Tyr(В)-JIеи-Нis(Е)-Pro"Y""0G

73 где А — тозил;

В - бензил;

E — - динитрофенил;

G — - водород или п-нитробензил;

У вЂ” имеет значения, указанные вьппе подвергают взаимодействию с реакционноспособным производным аминооксикарбоновой кислоты общей формулы III

W-X-М где Х имеет значения, укаэанные вьппе, W — бензилоксикарбонильная или трет-бутилоксикарбонильйая группа;

М вЂ” пентафторфенокси, и от полученного соединения общей формулы 1Ч

Ч-" Àrg (А) -Va 1 -Tyr (В) -I1eu-Н s (Е

-Рго-7-OG где А,В,Е,G,W,Õ и Y имеют указанные вьппе значения, отщепляют одновременно или ступенчато защитные группы.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Lajos Kisfaludy, М.Low, О.NYeki, Т.Szirtes, E.Shon, Die Vervendung von Pentafluorphenylestern bei .Peptidsynthesen, Justus Riebigs An nalen der chemic,l973, Heft 9,s.1421

2. Шредер 3., Любке К. Пептиды. ч. 1, M., "Мир", 1967, с. 116.

Составитель В. Волкова

Редактор Л. Ушакова Техред С.Мигунова Корректор M. Коста

Заказ 4258/8 Тираж 443 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4