Способ регенерации растенийлюцерны

Способ регенерации растенийлюцерны

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт кормов им. В.P.Âèëüÿìñà (71) Заявитель (54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИИ,ПРЦЕР Щ

lN VtTR0

Изобретение относится к сельско;, му хозяйству и может быть испольэова" но в селекции и семеноводстве, в частности для соматической гибриди5 зации, клеточной селекции, ускоренного размножения растений в исследованиях по фитопатологии, физиологии и генетике растений.

Известен способ ферментативного. выделения изолированных протопластов растений из клеток суспензионных культур, в частности сои, арахиса, фасоли fl).

Однако получить растения-регенеранты из таких протопластов до сих 15 пор не удавалось.

Наиболее близким к изобретению является способ регенерации растений люцерны из протопластов, выделенных с помощью ферментов из каллусов лис- 20 тового происхождения (2).

Однако этот способ применим только для растений, у которых .листовые эксплантаты образуют крупные, рыхлые каллусы, пригодные ля мацерации в растворе ферментов. Частота таких растений среди различных сортов и гибридов люцерны колеблется в пределах 10-30%. Таким образом, этот способ имеет лишь ограниченное приме« 30 нение. Минимальный срок, необходимый. для получения регенерантов этим спо-i собом, довольно продолжителен и составляет 5 мес.,а выход регенерантов в расчете на 1 каллус незначителен (в среднем получают 3 растения на 1 каллус).

Целью изобретения является ускорение процесса регенерации растений и повышение его эффективности.

Поставленная цель достигается тем, что листочки, то есть пластинки тройчатого .листа, культивируемых сортов и гибридов люцерны стерилизуют в

0,1В-ном водном растворе диоцида и после трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде делают на каждом из них ряд надрезов по всей площади пластинки и помещают на основную питательную среду Гамборга

В6 (3),которую дополнительно вводят

6000-8000 мг/л бактоагара и 200

300 мг/л нитрата аммония, содержание железа сернокислого (FeSO@ 7H+) увеличивают до 70-100 мг/л, трилона Б (Иа ЭОТА) до 25000-35000 мг/л и вносят следующие фитогормоныт 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д)- 816 мг/л, кинетин — 6-10 мг/л и а нафтилуксусную кислоту (НУК) — О,l852275

100% в закрытых, прозрачных сосудах.

В случае появления на листочках бактериальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним питательной среды. Состав среды В приведен в табл.1.

Т а б л и ц а 1

Количест- Витамин во микро элемента мг/л

Количество макроэлемента, мг/л

Количество витамина мг/л

Макроэлемент

Микроэлемент

2500

Мпяа, Н О

Никотиновая кислота

"3ВО3

150

P04. H 0 (ын ) 804

М9804 7Н О

Zn 0 . 7Н О

Иа Мо04- 2Н О

CuS04. 5Н, О

CoCE@ ° 6Н О

1.34

Тиамин-HCt

250

0,25 Мисинозит

0,025

100

Трилон Б (mazSmA) 37

0,75

Примечание: Сахаровы 20000 мг/л, рн 5,5.

14 ч. Выделившиеся протопласты отделяют от грубых примесей путем фильтрования через сетку с диаметром пор

100-125 мкм, а затем отМывают от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием (4-5 мин, 135160 g), используя для промывки 5,05,5%-ный раствор хлористого кальция (CaCC<. 6HZ0). После центрифугирования и удаления супернатанта к изолированным протопластам добавляют жидкую среду Гамборга В, содержание сахароэы s которой увеличивают до

25000-35000 мг/л, дополнительно вводят осмотик - D-маннит — 8500095000 мг/л и фитогормоныг ауксин (2,4-D) из расчета 0,5-2,0 мг/л и цитокинин - BAII - 0,5-1,0 мг/л или кинетин - 1,0-2,0 мг/л, а РН среды доводят до 6,0.

Образовавшуюся суспензию протопластов для окончательной очистки .- от примесей фильтруют через фильтр с диаметром пор 80-90 мкм ч инкубируют в закрытых прозрачных сосудах

18-24 ч в темноте, а затем при непрерывном люминесцентном освещении (400600 лк), температуре 26х1 С и относительной влажности воздуха 95-100%.

В течение инкубационного периода (24-30 дней) добавляют свежую питательную среду того же состава, но без осмотика и фитогормонов, в которую дополнительно вводят амннокис0,5 мг/л, а рн среды доводят до 5 8-

6,0.

Материал инкубируют 10-16 дней при непрерывном освещении люминесцентны:ми лампами (освещенность g,54,0 тыс.лк),температуре 26-1 С и относительной влажности воздуха 95CaC8z ° 2Н 0 150

РеЯ04. 7Н О 28

Через 10-16 дней развившиеся каллусы переносят в жидкую среду В5, содержание сахаровы в которой увели- 35 чивают до 25000-35000 мг/л и дополнительно вводят фитогормон - бензиламинопурин (БАП) 0,2-0,8 мг/л. Мате« риал инкубируют 6-8 дней в закрытых„ прозрачных сосудах на встряхивающих аппаратах с числом оборотов 100- 40

125 мин" при тех же параметрах освещенности, температуры и влажности, которые используют при инкубации листочков, Образовавшиеся через 6-8 дней суспензии клеток используют для выделения изолированных протопластов или субкультивируют путем добавления к 1 объему свежей среды того же состава 1 объема суспензии и через 68 дней инкубации повторно используют для получения протопластов.

Предназначенную для выделения протопластов суспензию клеток центрифугируют (4-5 мин, 135-160 9) и после удаления супернатанта (надосадочная жидкость) добавляют к оставшимся в осадке клеткам Раствор ферментов с осмотиком, содержащий,вес.В:

)1еллюлаза 4,.0-5,0

Пектиназа . 3,0-3,5 Щ

Хлористый кальций (Cact <- 6Н О) 5,0-5,5

Вода Остальное

Материал инкубируют в темноте при температуре 26-1 С в теченйе 12-, 0,25 Пиридоксин-НСВ 1

852275 лоту-L-аспарагин иэ расчета 1200, 1500 мг/л. Среду добавляют 5-7 раэ ,впервые через 6-7 дней после высева протопластов,а затем с интервалом 34 дня иэ расчета 1 объем свежей среды на 8-10 объемов суспенэни. 5

После образования из протопластов многоклеточных колоний (более 32 клеток в каждой) их переносят в свежую среду В, в которой содержание сахарозы увеличивают до 60000-80000 мг/л, добавляют L-аспарагин-500-750 мг/л и фитогормоны- (2,4-Д)-1, 5-2,0 мг/л и кинетин — 1,5-2,0 мг/л. Пересадку осуществляют путем добавления к 4-6 объемам свежеЯ среды 1 объема суспензии с колониями. Материал инкубируют

18-24 ч при тех же -параметрах, что и протопласты, а затем переносят на встряхивающие аппараты с числом оборотов 25-35 мин-(,освещенность повышают до 2000-2500 лк, другие парамет- 20 ры оставляют без изменений.

Через 10-15 дней многоклеточные колонии образуют каллусы, которые пересаживают в свежую среду того же состава, при этом содержание сахаро- g5 зы снижают до 40000-60000 мг/л, а в качестве фитогормона используют один бенэиламинопурин в концентрации 0,20,8 мг/л. Перееадку осуществляют путем добавления к 4-6 объемам свежей . среды 1 объема суспензии с каллусами, Материал инкубируют в закрытых прозрачных сосудах на встряхивающих аппаратах с числом оборотов 100125 мин -", освещенность повышают до

3000-4000 лк, температуру и относительную влажность воздуха оставляют беэ изменений.

Через 10-12 дней на каллусах обра-зуются мелкие (200- 500 мкм), зеленые эмбриоиды, которые пересаживают на 40 свежую среду того же состава, но без

L-аспарагина, содержание сахароэы снижают до 30000-40000 мг/л. Пересадку осуществляют путем добавления к 4-6 объемам свежей средй 1 45 объема суспенэии с эмбриоидами. -МатеВлияние возраста суспензионных культур клеток, состава и концентрации фитогормонов в питательной среде на выход жизнеспособных изолированных протопластов приведены в табл.2.

Ф риал инкубируют при тех же параметрах, что и каллусы.

Через 10-12 дней развиваются крупные (1,0-2,5 мм) зеленые эмбриоиды, которые пересаживают на агаризованную среду В (6000-8000 мг/л бактоагара) беэ гормонов н добавок. Ус-. ловия инкубации остаются прежними, 55

16 ч в сутки.

Через 15-20 дней развиваются проростки, KoThpHe пересаживают на ага ризованную среду Ry с разбавленной (lt2 — 1:3) концентрацией всех входящих в нее компонентов и инкубируют при тех же условиях. По мере развития растений на этой среде и появле- ния у них 2-3 тройчатых листьев и корней (через 20-30 дней) их пересаживают в почву и выращивают в обычных. условиях.

Работу, связанную со стерилизациеЯ листьев получением протопластов и пересадками, проводят в асептических условиях.

"П р.и м е р. Проводилась регенерация растений иэ протопластов, выделенных из клеток суспензионнйх культур люцерны. гибридной сортов Рамблер, Зайкевича и желтой сорта Дединовская.

При этом получены следующие результаты: 95% листочков, помещенных на питательную среду с тремя фитогормонами, через 14 дней образовали каллусы, которые помещали в жидкую питательную среду с 0„2 мг/л бенэиламинопурина из расчета 20 мг каллусной ткани на 1 мл среды и инкубировали на аппарате АВУ-1. (аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках) при 125 мин и амплитуде колебаний 20-30 мм. Через 7 дней иэ каллусов образовалась суспензия клеток, содержащая в среднем 120 тыс. клеток в 1 мл. Полученную суспенэию после центрифугировання и удаления супернатанта испольэовали для выделения протопластов, добавляя к оставшимся в осадке клеткам раствор ферментов с осмотиком, содержащий,вес.Ъ| целлюлазу Onozuka P=1500-4,0, пектиназу Serva 3,5, хлористый кальций (CaCg>. 6Н О)5,5 и дистиллированную воду — 87;О.

Раствор стерилизовали фильтрованием через стеклянный фильтр 3 6 5 (Schott

and Gen,jena, DDR). На 1 см э клеток,, оставшихся в осадке после центрифугиb ования., добавляли 1 мл ферментного раствора и инкубировали в чашках Петри в темноте при температуре 26-1 С

-ь о в течение 13 ч. Выделившиеся протопласты отделяли от -рубых примесей путем фильтрования через трехслойную капроновую сетку с диаметром пор

125 мкм, а затем отмывали от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием .(5 мин, 135-160 g), используя 5,5%-ный раствор хлористого кальция (CaCE<. 6Н О). K оставшимся в осадке протопластам добавляли жидкую среду с D-маннитом и фитогормонамиг 1) 2 4-0-0,5 мг/л + БАП

1,0 мг/л 2) 2,4-О-2,0 мг/л + кинетин-2,0 мг/л и после фильтрования суспанэии через стеклянный фильтр

ПС-1 высевали в чашки Петри (по 23 мл в чашку размером 60xl2 или

60х15 мм). Конечная концентрация протопластов составляла 40-60 протопластов составляла 40-60 тыс. в l мл..

852275

Таблица2, Возраст суспензионной куль туры, сут

) Количество протопластов из l мл клеточной сус- пенэии при концентрации фитогормонов, мг/л

SMI-0, 2 БАП1, 0

3,5 10

9,6 10 3,8 10+

3,7 10+

0,9- 10

1-4

3,9 ° 10 +

3,6 ° 10

6-8

10-14

16-20 б5

Таким образом, оптимальный период инкубации суспенэионных культур, предназначенных для выделения протопластов, составлял 6-8 дней. Наиболь- 2О ший выход жизнеспособных протопластов наблюдался при использовании в качестве фитогормона бензиламинопурина в концентрации 0,2 мг/л. Изолированные прото@ласты, полученные иэ суспенэионных культур, растущих в среде без фитогормонов, имели низкую жизнеспособность и были непригодны для культивирования.

Значительное влияние на жизнеспособность протопластов н темп клеточных делений оказывала концентрация фитогормонов в питательной среде, используемой для культивирования протопластов. Снижение концентрации фнтогормонов до 0,1-0,2 мг/л приводило к замедленному (на 2-3 нецели) развитию многоклеточных колоний и каллусов. Увеличение концентрации фитогормонов до 3-4 мг/л вызывало нарушения в процессе клеточных деле- 40 ний, ингибировало развитие многоклеточных колоний и каллусов. Оптю альные результаты были получены при использовании фитогормонов в концентрации 0,5-2,0 мг/л.

В период образования из протопластов многоклеточных колоний (25 дней) к инкубируемому материалу добавляли свежую среду, содержащую

1350 мг/л L-аспарагина. Первый раз среду добавляли через 7 дней после высева протопластов, а затем с 34-дневным интервалом еще 4 раза.

Финальная концентрация аспарагина

s инкубационной среде составляла

600 мг/л. 55

Добавление свежей среды с 3-4дневными .интервалами повышало темп клеточных делений, что приводило к ускорению процесса развития многоклеточных колоний на 7-10 дней по сравнению с еженедельным добавлением среды. Уменьшение интервала между добавками до 1-2 дней приводило к повреждению части клеток, вследстБЪП-0,2.. + кинетин - gô

2,4-В 0,1 вне резкого снижения осмотического давления питательной среды.

Образовавшиеся колонии пересажи-. вали в свежую среду, содержащую

80000 мг/л сахарозы, 530 мг/л L-аспарагина, 2 мг/л 2,4-D и 2 мг/л кинетина путем добавления к 1 объему суспензии 4 объемов свежей среды и инкубировали 18 ч при тех же условиях, что и протопласты (с целью стабилизации осмотического давления), а затем переносили инкубируемый материал на аппарат для встряхивания с круговым вращением C81m=0=

Shake ЕТД BDR и культивировали при 30 мин-", освещенности 2100>

ЙОО лк и температуре 26 1 С. Увеличение числа оборотов до 40-50 мин 1 приводило к повреждению колоний и их выбрасыванию на стенки чашек, снижение до 10-20 мин-1 уменьша о аэрацию питательйой среды, в результате чего срок, необходимый для развития каллусов из многоклеточных колоний, удлинялся на 7-10 дней. Таким образом, оптимальное число оборотов составляло 25-35 мин .

Через 14 дней из многоклеточных колоний образовались каллусы,которые пересаживали в свежую среду, содержащую 60000 мг/л сахароэы, 530 мг/л .

L-аспарагина и 0,2 мг/л БАП (к 6 объемам свежей среды добавляли 1 объем суспензии с каллусами). Материал инкубировали на аппарате АВУ-1 при 125 мин и освещенности 3500+ л200 лк до образования в суспенэии мелких, зеленых эмбриоидов (10 дней), Сусненэию с змбриоидами субкультнвировали путем добавления свежей среды того же состава, но без аспарагина (концентрацию сахароэй сии» жали до 40000 мг/л) и инкубировали в тех же условиях 10 дней.

Значительное влияние на процессы развития из протопластов многоклеточных колоний, каллусов и эмбриоидов оказывало введение в питательную среду аминокислоты — аспарагина.

Добавление этого 1соединения увеличивало число образовавшихся коло852275

10 ных колоний, однако для HopMaJIbHoaо прохождения процесса каллусогенеэа было необходимо присутствие в питательной среде L-аспарагина. ний в 1,75 раза по сравнению с конт-. ролем (среда беэ добавок). В контрольном варианте развитие продолжалось лишь до образования 8-16 клеточных колоний, которые впоследствии бурели.. Наряду с Ь-аспарагином, другая аминокислота — Ь-аргинин стимулировала образование многоклеточВлияние аминокислот на развитие колоний, тканевых структур и эмбриоидов приведено в табл.3.

Т а блица 3 тканеных структур 200-500 мкм

8-16 клеточных 32 клеточных колоний колоний

11625

15485

15485

Аспарагин

Аргинин

Контроль (без добавок) 9300 сочетаниями фитогормонов (2,4-D0,5 мг/л + БАП - 1,0 мг/л и 2,4-D2,0 мг/л + кинетин — 2,0 мг/л) и последующего культивирования в одинаковых условиях были получены аналогичные результаты.

Использование изобретения позволит значительно ускорить процесс регенерации растений иэ протопластов и повысить его эффективность. Высокий выход регенерантов позволит использовать данный способ в клеточной селекции, для генетической модификации растений, соматической гибридизации, ускоренного размножения и оздоровления растений и т.д, Добавление L-аспарагина стимулировало образование тканеных структур, из которых в дальнейшем развивались каллусы.. При инкубации каллусов в питательной среде с аспарагином .чйсло образовавшихся эмбриоидов возрастало в 3 раза по сравнению с контрольным вариантом (среда без добанок). Полученные эмбриоиды нормально развивались в среде беэ аспарагина.

Оптимальная концентрация L-аспарагина в инкубационной среде составляла 500-750 мг/л. Увеличение концентрации до 1000-1500 мг/л не-повышало эффективность действия аспарагина, а уменьшение до 100-250 мг/л 40 приводило к замедленному (на 5-10 дней) образованию многоклеточных колоний, каллусов и эмбриоидон.

Крупные, зеленые эмбриоиды пересаживали на агаризованную среду В - беэ гормонов, содержащую 30000 мг/л сахарозы и инкубировали при 16-часовом фотопериоде до образования проростков (17 дней). Проростки пересаживали на агариэованную среду В без гормонов с уменьшенной н 2 раза концентрацией всех компонентов. По мере развития иэ проростков растений с 2-3 листьями .и корнями (2025 дней) их пересаживали в почву и выращивали в обычных условиях. Растения-регенеранты были свободны от фитопатогенной инфекции, нормально росли и развивались, цвели и завязывали семена от перекрестного опыления и самоопыления. Период регенера-Эо ции (от протопласта до растения) составлял 95-100 дней. В расчете на

1 каллус было получено 300 растений.

При высеве изолированных протопластов н питательную среду с двумя 65

Формула изобретения

1. Способ регенерации растений люцерны 1n vitro включающий получение каллусов и суспензий клеток с последующим ныделением из них протопластон, и культивирование их н условиях, способствующих развитию многоклеточных колоний, каллусов, почек, эмбриоидов и растений, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения процесса регенерации растений и повышения его эффективности, протопласты выделяют из клеток суспензионных культур через 68 дней инкубации в среде с бензиламинонурином, изолированные протопласты инкубируют н жидкой питательной среде Гамборга В с фитогормонами с добавлением каждые 3-4 дня свежей среды с L-аспарагином, а образовавшиеся многоклеточные колонии пересаживают н свежую среду с фитогормонами и L-аспарагином и иикубируют на встряхивающих атпчаратах с

Добавка в Количество образованных в среднем на 50 тыс, питательную высеянных протопластов среду

852275

Составитель A.Ìåýåíöåâ

Техред A. Ач Корректор С.Шекмар

Редактор Н.Потапова

Заказ 5569/1 Тираж 700 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 числом оборотов 25-35 мин. до образования каллусов, которые пересаживают в среду с бензиламинопурином и L-аспарагином и инкубируют до образования эмбриоидов с последующей пересадкой их на среды, способствующие регенерации растений.

2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что суспензионные культуры клеток, предназначенные для вьфеления протопластов инкубируют в среде, содержащей 0,2-0,8 мг/л бензиламинопурина.

3. Способ по п.l, о т л и ч а ю— шийся тем, что изолированные протопласты инкубируют в среде, содержащей в качестве фитогормонов: ауксин — 2,4-D - -0,5-2,0 мг/л, цитокинин-беызиламинопурин 0,5-1,0 мг/л или кинетин 1,6-2,0 «и /л.

4. Способ по п.l о т л и ч а ю шийся тем, что среда, используемая для добавок в период образования из протопластов клеточных колоний, содержит 1200-1500 мг/л L-аспарагина,а среда для пересадок колоний и каллусов 500-750 мг/л.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. R. U. Schenk Q.Ñ. ИИ debrandt Crop Scienag: 1969, 9, 5, р. 629631.

2. Авторское свидетельство СССР

9 743647, кл. A Ol Н 3/00, 1978 (про15 тотип).

3. O.Gambory eta3 " Experlmentaf

СеИ Research, 50, 1, р. 151-158, 1968.