Способ получения ферментного препарата -маннаназы

Способ получения ферментного препарата -маннаназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61 j Дополнительное к авт, свид-ву (22) Заявлено 300879 (21) 2822267/23-04 (51) M

С 12 N 9/42//

С 12 R 1/125 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Государственный комитет

С,ССР но делам изобретений и открытий

Опубликовано 2 30831. Бюллетень № 3 1

Дата опубликования описания 230881 (5Ç) УДК 577. 15. . 07 (088. 8) (72) Авторы изобретения

A -A Á ° Паулюконис

C. — Ã.À. Фирантас и! а

1 ..

Всесоюзный научно-исследовательский а!нститут прикладной знзимологин (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА

Р -МАННАНАЗЫ

Изобретение относится к микробио" логической промышленности и может быть использовано для получения высокоочищенного ферментного препарата (!З-маннаназы, продуцируемого бактерия.ми Вас1Ицз sufti(.is.

Известны способы получения ферментного препарата -маннаназы,путем культивирования различных микрооргаииэмов в лабораторных условиях, в частности Aspergillus niger u

ВасИСиэ suftiCis.

Ферментный препарат Р-маннаназы получают путем культивирования Аврегg16Kus niger с последующим выделением фермента высаливаннем сернокислым аммонием и днализом или обессоливанием. на колонках с сефадексом.

G-25, многократной хроматографией на анионнтах н катнонитах (1). 20

Недостатками способа являются его многостадийность и трудоемкость,а также невысокий выход продукта(менее 40%), Наиболее близким является способ

2S получения ферментного препарата -маннанаэы путем культивирования бактерий BaciKCus suftifis -50 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральза

2 ные соли, в течение 45 ч с последую" щим выделением фермента из культуральной жидкости путем высаливания сернокислым аммонием, последующим диалиэом осадка, деколоризацней ферментного раствора, пропусканием через колонку с анионитом Duogite

A-2 и повторным высаливанием сернокислым аммонием (2).

Вызод продукта 62 Ъ.

Однако известный способ получения ферментного препарата Р -маннаназы имеет недостаточно высокий выход продукта, большую продолжительность культивирования и многостадийность очистки ферментного препарата с использованием дорогостоящих реактивов.

Цель изобретения — повышение выхода ферментного препарата -маннанаэы, удешевление и упрощение технологической схемы и ускорение процесса.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе получения ферментного препарата Р -маннаназы, в качестве продуцента из вида Baci(!(, us suft18is используют штамм

BacifEus suftifis G-78, культивирование проводят в течение 16-20 ч на питательной среде, содержащей ис857263 точники углерода, азота и минеральные соли, выделение фермента осуществляют путем осаждения трехкратным объемом этилового спирта при рН 5,0-5,2 и температуре 2-4 С и о флокуляцией с помощью полиакриловой кислоты при рН 4,3-4,4 в соотношении.полиакриловая кислота:белок

0,06:1 с последующим осаждением флокулянта раствором хлористого кальция при рН 6,2-7,0 и лиофилизацией полученного ферментного раствора.

Кроме того, раствор хлористого кальция используют в 10-50Ъ-ной кон центрации. .Существенными отличиями предлагаемого способа являются использование в качестве продуцента штамма Bacillus

suftiE is G-78, проведение культивирования в течение 16-20 ч и условия выделения фермента из культуральной жидкости. 20

Предлагаемый способ позволяет достичь выхода целевого продукта до 79t.

Средняя активность ферментного препарата -маннаназы 540 10 ед/г препарата. 25

Предлагаемый способ получения препарата ) -маннаназы является простым в практическом применении, менее продолжительным, позволяет ферментный препарат tI ман 30 наназы высокой степени очистки и с хорошим выходом. Способ не требует применения дорогостоящих ионитов и технологически сложных и длительных стадий хроматографии. Это дает возможность снизить трудоемкость процесса получения препарата Р -маннаназы и значительно его удешевить.

Предлагаемый способ легко может быть масштабирован в производственНЫх условиях. 40

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве продуцента р-маннаназы используют штамм BacilEus suftitis

G-78, засев продуцента производят 45 при рН 6,7 + +0,1, культивирование проводят при 37 С, продолжительность культивирования 18 + +2 ч.

По окончании роста культуры биомассу отделяют фильтрацией. Фильтрат 50 подкисляют разбавленной уксусной кислотой до рН 5,0-5,2 и осаждают тремя объемами з"илового спирта. Осаждение проводят охлажденным этиловым спиртом при 2-4 С. Осадок собирают филь рацией или центрифугированием, после чего растворяют в минимальном количестве подкисленной уксусной кислотой до рН 4,3-4,4 воде и производят флокуляцию 1Ъ раствором полиакриловой кислоты. Флокуляцию прово- 60 дят при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием или фильтрацией. Полученный осадок растворяют в воде и сухим углекислым натрием доводят 65 рН до 6,5. После этого флокулянт осаждают 20Ъ-ным раствором хлористого кальция. Осажденный флокулянт отделяют центрифугированием, а полученный ферментный раствор лиофильно высушивают.

Пример. Для получения высокоочищенного ферментного препарата P— маннаназы в качестве продуцента используют штамм Вас1ЕЕ us sufti(! is G-78.

Питательную среду готовят следующего состава,Ъ: крахмал — 6,5; кукурузный экстракт — 2,7; сухие пивные дрожжи -0,12; (NH4)< НРΠ— 0,5;

К ЯО4 — 0,33; NgS04. ° 7 Н О вЂ” 0,016;

MnS04 — 0,1; СаСà — 0,013, Культивирование проводят на бродильных установках типа Биолафит . Для охлаждения этилового спирта используют холодильную установку Ультракриомат .

Стерильную питательную среду при 45oС, рН 6,7 засевают штаммом

Baci60us sufti(.is G-78. В течение двух часов температура снижается до 37 С, которую и поддерживают во время всей ферментации. В начале ферментации рН снижается до 6,1+0,1, потом повышается и в дальнейшем рН автоматически поддерживают в пределах

6,4-6,6. Продолжительность ферментации 18 + 2 ч. Конец ферментации определяют rrc максимальной ферментативной активности Р-маннаназы. 3а условную единицу активности принято такое количество фермента, которое уменьшает относительную вязкость галактоманнана (полигалактоманнан из семян Ceratonia si(iqua, Фирма Sigma СИЛ) на одну миллиединицу за одну минуту при 40 С.

По окончании Ферментации культуральную жидкость охлаждают до 10 С и отделяют биомассу фильтрованием.

К 10 л охлажденного до 2 С и подкисленного разбавленной уксусной кис лотой до рН 5,0-5,2 фильтрата постепенно добавляют 30 л охлажденного до -200С этилового спирта. При этом температуру смеси поддерживают около 2 С. Образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают одним литром этилового спирта. Далее осадок растворяют в 1 л воды, подкисленной уксусной кислотой до рН

4,35, и добавляют флокулянт (1Ъ раствор полиакриловой кислоты) из расчета 0,06 мг ПАК на 1 мг белка.

Полученный осадок центрифугируют

30 мин, 6000 об/мин. Далее осадок растворяют в 100 мл воды, предварительно подщелачивая до рН 6,5 сухим углекислым натрием. К полученному раствору добавляют 20Ъ раствор

СаС0 из расчета 0,78 вес.ч. СаСО на 1 вес.ч. IIAK. Осажденный Флокулянт отделяют центрифугированием

857263

Степень Выход, очйстки Ъ

Наименование Общая ак- Общий стадии тивность, белок усл.ед. мг

Удельна активность, ед/мг

Фильтрат (10 л) 342 ° 106 20 10 3 17 .10 1

100

После осаждения этанолом

3 8 10 2,2 ° 10 144 10 8,4

После флокуляции с ПАК

284.10 520 545 10 31,7

После лиофилизации

541 10 31

271 10 500

Формула изобретения при рН 4,3-4,4 в соотношении полиакриловая кислота : белок 0,06:1 с последующим осаждением флокулянта раствором хлористого кальция при рН 6,2-7,0 и лиофилизацией полученного ферментного раствора.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что раствор хлористого кальция используют в 10-50В-ной концентрации.

Источники информации, принятые ва внимание при экспертизе

1. Tsuj1saka У., Hiyama K., 40 Takenishi S., Nippon Novi Kaqaki.

Kaishi, 1972, 46, 155-161.

2. Shigenori Emi, Gnihiro Fukumoto, Takeniko Ysmamoto. Crista ECisation апй Боте, Properties of Mannanase. — . ц Agr. Вход. Chem, 1972, voF.36, Ne 6, 991-1001 (прототип}.

Составитель О. Скородумова

Техред .Т,Маточка Корректор М. Демчик

Редактор В. Лазаренко

Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 7149/43

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

20 мин, 8000 об/мин, а полученный ферментный раствор лиофильно высушивают.

1. Способ получения ферментного препарата Р-маннаназы, предусматривающий культивирование продуцента вида Baci(6us sufti(is на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, и выделение фермента из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, упрощения, ускорения и удешевления процесса, s качестве продуцента иэ вида Вас НВ цз suf ti 6 используют штамм Bacillus sufti8is

G-78, культивирование проводят в течение 16-20 ч, выделение фермента осуществляют осаждением треккратным объемом этилового спирта при рН 5,05,2 и температуре 2-4ОC и флокуляцией с помощью полиакриловой кислоты

Средние показатели процесса получения высокоочищенного препарата -маннаназы представлены в таблице.