Способ получения активированных носителей

Способ получения активированных носителей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ТЕЛЬСТВУ

Союз Соеетских

Соцналнстическик

Республик но859372 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 010677 (21) 2490496/23-04 я)м. кл. с присоединением заявки йо

С Oi7 G 7/02

Государственный комитет

СССР но аеааи изобретений н открмтий (23) Приоритет—

Опубликовано 300881 бюллетень М 32

Дата опубликования описания 30.0881: (53) УДК 577.15.07 (088.8) А. И. Кестнер, Х. Я. Киппер, К.А. Кивисилл

ХP. Егоров, AÝ. Эрин, А.Я. Озолиньш, А.К. Арен, Д.Я. Дайя и И.Г. Страздиня

F ю

1 (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ AKTHBHPOBAHHbK

НОСИТЕЛЕИ

Изобретение относится к химической и микробиологической промышленности и может быть использовано для получения активированных носителей для иммобилизации ферментов. Получаемые

5 материалы могут быть применены как химические реактивы и промышленные катализаторы для проведения ферментативных реакций в химической, фармацевтической и пищевых отраслях промышленности.

Иммобилизация ферментов путем их присоединения к нерастворимым носителям является хорошо известным способом улучшения технологических по- l5 казателей этих биокатализаторов.

Из большого числа носителей заслуживают внимания органоминеральные материалы, в частности покрытые полимерами пористые кремнеземные мате- 20 риалы. Носители такого типа характеризуются хорошими гидродинамическими свойствами и достаточной стабильностью получаемых препаратов.

Свойства получаемых препаратов во

25 многом зависят от метода внесения и активации полимерного слоя на носителе.

Известны способы получения модифицированных твердых носителей путем 30 покрытия поверхности носителя полимером. Например, в качестве полимера используют полиакролеин. Слой полимера образуется на поверхности носителя в результате пропитывання носителя мономером, содержащим свободные альдегидные группировки..

Полимеризация происходит на поверхности носителя. Иммобилизация фермента производится по реакции между альдегидными группами носителя и аминогруппами фермента (1).

Этот способ позволяет получать иммобилизованные на органоминеральных носителях ферменты. Однако он ограничивает модификацию носителя только альдегидсодержащими полимерами. Связывание ферментов через альдегиды не всегда позволяет получить активные препараты. Кроме того, получаемые линейные полимеры обладают значительной растворимостью и не скрепляют неорганическую структуру носителя.

Известен также способ получения водонерастворимого гидрофильного носителя со свободными карбонильными (преимущественно альдегидными) группировками в результате полимериэации

859372 акролеина или сополимеризации акролеи- на и стирола в присутствии 1,6- гексаметилендиамина. Иммобилизацию фермента производят также с помощью реакции между альдегидными группами носителя и аминогруппами фермента (2).

Данный способ ограничивает модификацию носителя только альдегидсодержащими полимерами. Связывание ферментов через альдегиды не всегда позволяет получить препараты с удовлетворительной стабильностью. Иммобилизованные ферментные препараты, полученные данным способом, обладают очень низкой стабильностью при хранении и только использование дополнительных приемов способствует некоторому повышению стабильности препаратов.

Известен также способ получения воднонерастворимого ферментного препарата путем микрокапсулирования фермента в слой полимера, причем фермент предварительно адсорбируют или ковалентно связывают на поверхности неорганического носителя. Полимер образуется из полиамина (например, гексаметилендиамина или этилендиао мина) и полиизоцианата при 0-4 С (3) .

Способ иммобилизации ферментов покрытием уже связанного фермента полимерной микрокапсулой создает дополнительное диффузионное сопротивление для субстрата. Катализаторы, полученные путем микрокапсулирования фермента в слой полимера, могут оказаться трудно применимыми при проведении гидролиза макромолекулярных субстратов, в частности, таких, размер молекул которых превышает или равен размерам молекул иммобилизованного фермента.

Предложены для иммобилизации ферментов стеклянные шарики, покрытые полимерным слоем. В качестве полимера используют гидролиэованный найлон или сополимер этилена и ангидрида малеиновой кислоты. Полимерный слой пропитывают раствором фермента и поперечно сшивают глутаровым альдегидом (4) .

Описанный способ дает материалы с хорошими гидродинамическими показателями, но сравнительно небольшой удельной поверхностью. Кроме того этот сйособ, по которому сшивание полимерного слоя сочетается с иммобилиэацией фермента, не позволяет провести реакцию в условиях (например, при повышенных температурах), необходимых для получения стойких полимерных носителей,так как при этих температурах часто протекает инактивация фермента.

Известен также способ получения активированного носителя путем пропит ки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом. В качестве полимсра исполь зуют полиакролеин. Носитель (фарфор, измельченное стекло) пропитывают мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полимериэация происходит на поверхности носителя.

В результате модификации таким способом получают носитель со свободными альдегидными группами . Иммобилизация фермента (трипсина, папаина) производится путем, взаимодействия альдегидных групп носителя с аминогруппами фермента (5).

Недостатком данного способа является малая операционная стабильность получаемых активированных носителей.

Покрытие неорганического материала

15 линейными полимерами, образующимися при полимеризации винильных полимеров не обеспечивает достаточную нерастворимость, а следовательно, стабильность получаемых ферментных

20 препаратов. Этот способ также ограничивает модификацию носителя альдегидсодержащими полимерами, а связывание ферментов только через альдегидные группы не всегда дает возможность получать препараты с высокой активностью и хорошей стабильностью. Известный способ не обеспечивает также высокого содержания белка на единицу носителя. При иммобилизации трипсина достигается связывание 0,2 мг белка на 1 мл носителя.

Цель изобретения — повышение операционной стабильности носителей для иммобилизации биоактивных веществ.

Укаэанная цель достигается тем, 35 что в способе получения активированных носителей с повышенной операционной стабильностью путем покрытия пористого неорганического носителя с диаметром пор 200-2000 Й органичес40 ким пленкообразующим веществом, содержащим реакцнонноспособные группы, в качестве пленкообраэующего вещества используют эпоксидную смолу и проводят ее отверждение на носителе полиэтиленполиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:2 при 100-120 С в течение не менее 1 ч, после чего материал обрабатывают реагентс6ч, выбранным иэ группы, включающей глутаровый аль5© дегид, динэоцианат адипиновой кислоты, и -бензохинон и бромциан.

Способ осуществляется следующим образом.

Пористые неорганические носители

5S с диаметром пор 200-2000 А (силохром или силикагель) смачивают 1,7Ъным раствором эпоксидной смолы в ацетоне (9 объемов раствора на 5 вес.ч. неорганического носителя). Ацетон р выпаривают и проводят затвердение посредством кипячения носителя в 2Вном водном растворе полиэтиленполиамина (соотношение эквивалентов эпоксидной смолы и амина 1:2) в течение 1 ч. Носитель отфильтровыва859372

30 ют, промывают водой, ацетоном и сушат в термостате при 100 С . В результате получают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 150-200 мкэкв на 1 г носителя. Носитель можно использовать непосредственно для иммобили зации белков за счет взаимодействия, с аминогруппами, а также можно дополнительно активировать, создавая ,на полимерной пленке реакционноспособные группы различной прирбды. !О

Подходящими активаторами в данном случае являются глутаровый альдегид, дииэоцианат адипиновой кислоты,и— бенэохинон и бромистый циан. Активацию укаэанными реагентами проводят описанными в литературе методами.

П р и м е p l. Получение носителя, модифицированного эпоксидной смолой.

Для получения носителя проводят пропитывание кремнеэемного материала 20 раствором эпоксидной смолы и затем затвердение водным раствором полиэтиленполиамина в количестве свыше эквимолярного (соотнсшение эквивалентов 1:2) . 25

5 г силохрома или силикагеля смачивают 9,0 мл раствора 1,7% эпоксидной смолы в ацетоне. После выпаривания растворителя проводят затвердение

15 мл 2%-ного водного раствора полиэтиленамина кипячением при 100 С в течение 1 ч. Затем носитель фильтруют, промывают водой и ацетоном и высушивают в термостате при 100 С.

В результате получают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 150 мкэкв на 1 г носителя. Полученный носитель используют для иммобилизации протеолитических ферментов (трипсина, химотрипсина, панкреатина) с помощью 40 бифункциональных реагентов глутарового альдегида и диизоцианата адипиновой кислоты, п -бензохинона и бромциана.

Пример 2. Получение нераст- 45 воримого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, активированием глутаровым альдегидом.

К 5 r модифицированного эпоксид- 50 ной смолой носителя (пример 1) добавляют 15 мл 2%-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого материал омывается дистиллированной водой от непрореагировавшего глутарового альдегида на воронке

Бюхнера до исчезновения глутарового альдегида в промывной воде, и к влажному активированному носителю добавляют 5 мл раствора химотрипсина с концентрацией 50 мг/мл в боратном буфере рН 8,0. Смесь перемешивают, вакуумируют для удаления воздуха из пор и выдерживают при 20 С в течение 1 ч. После инкубации препаpar промывают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0, 1М раствором хлористого натрия и затем еще боратным буфером, добавляя эти растворы порциями. Объем промывных вод составляет 100 мл ° Полученный иммобилизованный препарат хранят во влажном виде в боратном буфере в холодильнике.

Ферментативную активность препарата определяют на синтетическом субстрате — этиловом -эфире ацетилтироэина (АТЭЭ). Активность равна

550 Е/г. Стабильность препарата оценивают по остаточной активности после проведения промывки препарата

100 мл 2%-ного раствора казеина рН

8,0 в колонке с диаметром 6 мм и высотой столба препарата 70 мм в течение 24 ч. После такой помывки сохраняется 70% от исходной активности.

Пример 3. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, актнвированием диизоцианатом адипиновой кислоты.

К 5 г модифицированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) добавляют 20 мл 0,25 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле и смесь кипятят при 110 С в течение

1 ч. После этого носитель фильтруют, промывают ацетоном и высушиваю-. при

110ОС. Вследствие такой обработки получают носитель с активными изоцианатными группами. Такой носитель смачивает 8 мл боратного буфера.

Иммобнлизацию проводят как описано в примере 2. Получают препарат химотрипсина с активностью на АТЭ9

1900 E/ã. После промывки препарата

2%-ным раствором казеина сохраняется 41% исходной активности. При иммобилизации панкреатина получают препарат с активностью 1100 Е/г(на АТЭЭ), после промывки казенном сохраняется

32% от исходной активности °

Пример 4. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, активированием р -бензохиноном.

5 г модифицированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) нагревают с 20 мл 0,5%-ного водного раствора и -бензохинона на водяной бане в течение 1 ч. Затем носитель промывают водой и ацетоном и высушивают при комнатной температуре. Активированный таким путем носитель смачивают 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию химотрипсина проводят как описано в примере 2. Получают препарат с активностью на АТЭЭ 6800 Е/г.

После промывки препарата 2%-ным раствором казеина остаточная активность составляет 57% от исходной.

859372

Формула изобретения

Составитель A. Бочаров

Техред Л. Пекарь корректор Г. Наэ аров а

Редактор В. Петраш

Тираж 397 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 7466/39

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 5. Получение нерастворимого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного эпоксидной смолой, активированием бромцианом.

5 r модифицированного эпоксидной смолой носителя (пример 1) нагревают с 20 мл 1,1Ъ-ного водного раствора бромциана на водяной бане в течение

1 ч. Затем носитель промывают водой и высушивают при комнатной температуре. Получают носитель с активными циан-группами. Активированный таким путем носитель смачивают 8 мл боратного буфера. Иммобилизацию химотрипсина проводят как описано в примере 2

Получают препарат с активностью 15

33,6 Е/r (активность определяют на

2%-ном казеине) . После промывки препарата 2%-ным раствором казеина остаточная активность составляет 16% от исходной. 20

Предлагаемый способ позволяет по лучать носители, в которых внутренняя поверхность пор покрыта слоем действительно нерастворимого полимера, содержащего любые реакционноспособные группы, необходимые для иммобилизации ферментов. Образование в порах носителя полимерной пленки закрепляет структуру носителя, уменьшает нежелательное ацсорбционное 3() взаимодействие фермента с носителем и предотвращает вымывание фермента с носителя из-за растворимости кремнезема при рН 7 и выше. Способ позволяет получать препараты иммобилизо- 35 ванных ферментов с повышенной стабильностью и повышенной удельной активностью на грамм носителя.

Способ получения активированных носителей путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, содержащим реакционноспособные группы, отличающийся тем, что, с целью повышения операционной стабильности получаемых материалов, в качестве пленкообразующего вещества используют эпоксидную смолу, проводят ее отверждение на носителе полиэтиленполиамином в соотношении эквивалентов эпоксидной смолы и амина

1:2 при 100-120 С в течение не менее ,1 ч, после чего материал обрабатывают реагентом, выбранным из группы, включающей глутаровый альдегид, дииэоцианат адипиновой кислоты,у -бенэохинон и бромциан.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент ФРГ 9 2229298, кл. С 07 G 7/02, опублик. 1972.

2 ° Патент ФРГ 9 2104810, кл. С 07 G 7/02, опублик. 1971.

3. Патент Великобритании 9 1396714, кл. С 07 G 7/02, опублик, 1975.

4. С. Horvath. Pellicular immobii1ized enzymes Bioch. Blotch. Acta.

1974ю 358, 164-177.

5. Патент Великобритании М 1342186, кл. С 07 H 1/02, опублик. 1973 (прототип) .