Способ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных

Способ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е < 859440

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ .СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (8 l ) Дополнительное к авт. с вид-ву(22) Заявлено 28.02. 79 (21) 2729271/28-,1 3. с присоеаинениехт заявки М— (23) Приоритет—

Опубликовано 30.08,81. бюллетень М 32

Дата опубликования описания 30,08.81 (53)M. Кл.

С 12 и 9/88

3ЪоудератеснныН квинтет

СССР но аелаи нзаоретеннй н открытнй (5Э) УДК 612 ° 315. . 1 (088. 8) (72) Автор изобретения

С. П. Сяткин

Университет Дружбы народов им. Патриса Лумумбы - -. =(7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРНИТИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ

В ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к биохимии и касается исследований в энзимологии.

Известен способ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных ,путем инкубации их с орнитином с последующим проведением реакции .динитрофенилирования и колориметрией конечного продукта (lj.

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности.

Цель изобретения — повьппение точности способа.

Указанная цель достигается тем, что способ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных осуществляют путем инкубации их с орнитином с последунхцим проведением реакции динитрофенилирования и колориметрней конечного продукта, ткани перед инкубацией гомогенизируют в присутствии пиридоксальфосФата и дитиотреи2 тола, взятых в соотношении 4:1 инку-бацию ведут также в присутствии пос- леднихтзатем инкубаты обрабатывают хлорной кислотой, центрифугируют а к сунернатанту перед динитрофейилированием добавляют Na C(4 .

Пример, Орнитиндекарбоксилаза (ОДК) не выдерживает замораживания, позтому в качестве источника фермента используют свежеприготовленньй суиернатант 33Ж-ного гомогеиата (из расчета l:2 вес на объем), полученный центрифугированием при

20000 с1 в течение 20 мин. Ткань.. гомогенизируют в 0,05 мМ фосфатном буфере (рН 7,2) содержащим 0,1 ммоль/л дитиотреитол и 0,4 ммоль/л пиридоксальфосфат. Все манипуляции с ткао нью проводят на холоде при 2-4 С.

Инкубационная смесь содержит в

0,4 мл конечного объема 4 ммоль орнитина 20 мкмоль пиридоксальфосфата, 5 мкмоль дитиотриетола, 859440

Формула изобретения

5 ммоль К, а-фосфатного буфера и

9,5 0,68 мг белка (источник фермента) . Водное термостатирование при

37 С прекращают через 1 ч и добавляют Q,1 мл 0,2 M НС104. Осадок отделяют центрифугированием при

6000 об/мин в течение 5 мин. Количество образовавшегося путресцина. определяют с помощью 2,4-динитро1-фторбензола (ДНФБ). Для динитрофенилирования берут 0,3 мл супернатанта, 25 мг Na CO 10Н О и 0,3 мл реактива, содержащего ДНФБ, который готовят непосредственно перед работой, смешивая реактив А (0,65 мл

ДНФБ в 50 мл ацетона) с реактивом

В (0,066 М раствор Na>8<0-1) в соотношении 1: 10, Образование ДНФ-производных орнитина и путресцина осуществляют в водяной бане при

60-70оС в течение 1О мин. ДНФ-пут ресцин извлекают энергичным встряхивапием с 4 мл хлороформа и центрифугиру|от при 5000 об/мин в течение

10 мин. Д1!Ф-орнитин остается в водяной фазе. Интенсивность поглощения света хлороформенным слоем измеряют при 350 нм на спектрофотометре СФ-16, Контролем служит проба, в которчю орнитин добавляют непосредственно . перед динитрофенилиоованием. Калибра" вочнчю кривую строят для стандартного препарата путреспина 2НС1. Устранение перед динитрофенилированием и„= анализируемой пробы белка центрифугированием после добавления HC10ig увеличивает возврат до 102 97+2,223

Для нейтрализации НС10 и защелачивания фазы до рН 9 добавляют порошок

Na С0 10 НоО. Дитиотреитол используют для стабилизации дисульфидных связей ОДК. Добавление пиридоксальфосфата улучшает воспраизводимость результатов. Качественный состав и количественное соотношение компанен тов инкубационной среды подбирают заново.

3а единицу активности принимают

1 нмоль путресцина, образованного за 1 ч при 37 С. Удельную активность фермента (А) выражают в единицах активности на 1 мг белка. Белок определяют по методу Ноури. Результаты опытов подвергают статистической обработке методом Ионцевичюте-Эрингене с использованием фактора Монденгауэра. Различия между

4 генеральными средними 1Х) расценивают как достоверные при значении

p < 0,05.

Объектом исследования слчжат штаммы перевивных гепатом Г-27, Г-46, регенирирующая печень, печень интактных животных и животных, получивших канцероген: диэтилинтрозоамин (ДЭНА).

Гепатому Г-46 пассир лот на самцов мышей линии СЗНА. В остальных опытах используют беспородных крыс. Частич— ную гепатоэктомию проводят по методу

Higgins u Anderson. ДЭНА вводят внутрибрюшинно один раэ в неделю в течение двух месяцев из расчета .100 мг/кг веса животного. Всего каждому животному вводят 154 мг концерогепа.

20 Ошибка метода менее ЗЕ, чувствительность равна «+0,1 нмоль пробу, воспроизводимость результатов близка к 1007..

Зависимость оптической плотности (ЬД350) от содержания ДНФ-путресцина в пробе сохраняет линейный характер в диапазоне от 0 до 150 нмоль. Оптимум рН для ОДК остается постоянным в узкой зоне значений от 6,4 до 6,8 и не зависит от рН буфера для гомогенизации, в то время как удельнал активность ОДК снижается при рН 6,6.

Обнаружено высокодостоверное увеличе35 ние активности ОЛК в регенерирующей печени, печени животных, получавших

ДЭНА, и гепатомах à — 27 и Г-46.

Предлагаемый способ позволяет повысить точность и чувствительность способа.

Способ определения орнитиндекарбоксилазы в тканях животных путем инкубации их с орнитином с последующим проведением реакции динитрофени50 лирования и колориметрией конечного

1 продукта, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности способа ткани, перед инкубацией гомогенизируют в присчтствии пиридоксаль-. фосфата и дитиЬтреитола, взятых в соотношении 4:1 инкубапию ведут также в присутствии последних, затем инкубаты обрабатывают хлорной ки

859440 нотой, центрифугируют,a к супернатанту перед динитрофенилированием до6aш1яют Na С0 .

Источники информации, \ принятые во внимание при зкспертизе

1. Закревский В.П. Определение орнитиндекарбоксилазы у микроорганизмов с помощью 2 -динитро-1-фторбен.зола. Сборник научных работ Волгоградского мединститута, 1973, т.26, с. 375 °

Составитель 6» Малютина

Редактор К. Лембак Техред Ж.Кастелевич Корректор f. Коста

Заказ 7472743 Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент г. Ужгород, ул. Проектная, 4