Анионообменный материал для разделения биологических макромолекул и способ его получения

Патент 867284

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

<и>867284 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 290776 {21)2384451/23-26 (зим, кл.

В 01 J 20/10 (23) Г)риоритет вЂ” (32) 290775

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (31) 73094 (33) Люкс ембург

Опубликовано230981, Бюллетень Мо 35 (53) УДК 661.183.

12 (088.8) Дата опубликования описания 230981 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Жан-Луи Тэйо, Мишель Тарди (Франция) Иностранная фирма Энститю Мерье (Франция) (71) Заявитель (54) АНИОНООБМЕННЫИ МАТЕРИАЛ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ

БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И СПОСОБ ЕГО

ПОЛУЧЕНИЯ

Известный способ получения адсорбента для разделения биологических макромолекул, заключающийся в нанесении путем адгезии на поверхность мелкодисперсного силикагеля типа аэроснла декстрана и последующей термообработки полученного материала при 100-5000С под вакуумом (1).

Недостатком данного способа является малая емкость полученного материала по отношению к таким компонентам как альбумин или гемоглобин.

Наиболее близким к предлагаемому 15 изобретению по технической сущности и достигаемому результату является анионообменный материал для разделения биологических макромолекул, содержащий минеральный носитель, в ка- 2() честве которого используют перлит, активированный уголь, диатомитовую землю, целлюлозу или их смеси, поверхность которого покрыта водорастворимым полимером, выбранным иэ группы 25 алкилениминов или полиалкиленполиаминов с молекулярным весом 1000, а также способ его получения, заключающийся в пропитке носителя водным раствором полимера (2). ЗО

Недостатками известного материала я ляются его плохие физико-механические характеристики и малая обменная емкость по отношению к биологическим макромолекулам.

Цель изобретения - создание анионообменного материала, обладающего улучшенными физико-механическими характеристиками и повышенной обменной еркостью .по отношению к биологическим макромолекулам.

Поставленная цель достигается тем, что анионообменный материал для разделения биологических макромолекул, содержащий минеральный носитель, в качестве которого используют макропористый водонерастворимый окисел, и водорастворимое полимерное вещество, в качестве которого исттольэуют полисахаридные полимеры, берут при следующем соотношений компонентов, вес. Ът

Полисахаридные полимеры 2,0-20,00

Неорганический окисел Остальное.

При этом анионообменный материал в качестве макропористого водонерастворимого окисла содержит двуокись

867284 кремния анионного типа с удельной поверхностью 5-80 м /г и средним диаметром пор 50-1000 ммк.

Кроме того, анионообменный материал в качестве полисахаридных полимеров содержит соединения с молеку-4 б лярным весом 10 вЂ” 10 дальтон, имеющих общую ФорМулу .- 1

R вЂ” (СН ),„- Н, где R - остаток декстрана, крахмала, целлюлозы или агароэы)

n - целое число от 1 до 70, предпочтительно от 2 до 5;

В„ и Н2 вЂ одинаковые или различные радикады вЂ” CI- р, CH 1CH З(CH ОН (СП )2 ОН или

-CH g -CH0H -СН д °

Отличительным признаком способа получения анионообменного материала Щ является пропитка макропористогo Во донерастнсримого неорганического окисла 1-10Ъ-ным водным раствором по-. лисахарида при рН 3-12 и последующая сушка материалов при 40-120 Е до постоянного веса.

Пористыми неорганическими носителями могут являться окиси алюминия, магния(титана или их синтетические или природные произнодне»,е, такие как стекла, силикаты, каолин и т.д.

Лмие-:ироваеень>й полисахаридный полимер наносится на пористый неорганический носитель путем импрегнироиания, причем механизм адгезии позволяет успешно наносить покрытия, на такие пористые носители, как окись алюминия с неотрицательной поверхностью.

Выбранные интервалы структурных характеристик пористого неорганического носителя являются оптимальными, 4() так как в случае больших поверхностей или малых диаметров пор внутренняя поверхность носителя станонится недоступной для аминиронанного полисахаридного полимера, а возможно, также, и для подлежащих разделению макромолекул. В зависимости от ныбранного . варианта изобретения пористый неорганический носитель представляет собой двуокись кремния или окись алюминия и предпочтительно представляет собой пористую двуокись кремния анионного типа. Можно испольэонать также пористые двуокиси кремния, площадь понерхности которых составл;чет соответственно 50, 25 и

10 м /г.

Аминированный полисахаридный полимер, который используют для импрегнирования, должен относиться к отчетливо анионному типу и иметь хорошие 40 гидрофильные свойства.

Предпочтительным янляетая использование диэтиламинодекстрана (ДЕЛЕ) (соединение с молекулярным весом

500000) и четвертичного диэтиламино-, g$ декстрана (OAE), а также соединения, известного под названием крахмал

ДЕЛЕ (диэтиламинокрахмал) .

Технология способа получения анионообменного материала состоит в следующем.

Пористую неорганическую окись в виде сухого порошка вводят в хрома тографическую колонку и проводят промывание и гомогенизацию для удаления пузырьков воздуха, пропуская для этой цели кислый раствор, например 0,1 н. соляную кислоту. После этого пропускают через колонку буферный раствор с величиной рН 3-12 до достижения равновесного состояния.

Затем через колонку на -холоду или при нагревании пропускают аминированный полисахаридный полимер, растворенный в приведенном выше буферном растворе или в воде, величина рН которой установлена на том же уровне.

После этого избыток аминированного полисахаридного полимера удаляют путем промывки указанным выше буферным раствором, а затем раствором соли, например раствором тринатриеной соли лимонной кислоты; отсутствие в конечном элюате аминированного полисахаридного полимера может быть установлено путем электрофореза на ацетилцеллеолозе и окрашинании пластинки пунцовым красным или осаждением в присутствии полиакрилоной кислоты.

Затем пропитанный материал сушат в печи при температуре, находящейся н интервале между 50 и 120 С, предпочтительно при температуре 80"C, до достижения постоянного веса, гомогенизируют и просеивают для удаления возможных агломератов. Материал, полученный предлагаемым способом, используют в колонке после предварительного пропитывания при помощи буферного растнора или раствора

0,5 М по цитрату, рН 4 или 0,05 М по цитрату, рН 6,8; для обратимого поглощения биологических макромолекул, например белков, в количестве

40-200 мг белка на 1 r сорбента..

Предлагаемый способ позволяет получать материал, покрытие которого, состоящее из аминированйого полисахаридного полимера, фиксируется практически необратимым образом.

Так, этот материал можно промывать 0,1 н, соляной кислотой, раствором гидрата окиси натрия или аммиака с концентрацией 0,1 н, без.ухудшения способности к обмену анионов.

Если возникает необходимость в регенерации пористой неорганической окиси, то производят обработку материала в значительно более жестких условиях, например при помощи дымящей азотной кислоты.

Пример 1. 10 г сферозила

XOCOQ5 помещают в колонку.лля хро867284 матографирования, насыпая, непосредственно, сухой и гомогенный порошок, что облегчает заполнение колонки. После этого э колонку при помощи перистальтического насоса вводят 100 мл 0,1 н. соляной кислоты со скоростью подачи 500 мл/ч для того, чтобы промыть, пропитать колонку и вытеснить все пузырьки воздуха (предпочтительно ведут элюирование в восходящем потоке) . Затем в колонку вводят буферный раствор с величиной рН 3-12 до достижения равновесного состояния, что контролируется измерением величины рН и удельным сопротивлением буферного раствора на выходе из колонки. После этого со скоростью 100 мл/ч вводят примерно

20 мл 1Ъ-ного раствора декстрана (ДЕАЕ) в вышеуказанном буферном растворе или в воде,.величину рН которой устанавливают на требуемом уровне. 20

После этого избыток не фиксированного декстрана элюируют тем же буферным раствором, а затем 0,05 М раствором цитрата с величиной. рН 4 и 0,05 Mq раствором цитрата с величиной рН 8, которые пропускают со скоростью

1000 мл/ч. Отсутствие декстрана ДЕАЕ в конечном элюате определяют методом электрофореза. на ацетилцеллюлозе и по окрашиванию пластинки пунцовым красным или методом осаждения в присутствии полиакриловой кислоты. Пропитанный таким образом сорбент сушат в печи при 40-120С С, предпочтительно при 80 С, в течение необходимого периода времени (например 15 ч) до дос- З5 тижения постоянного веса. Образовавшийся в результате сушки порошок гомогенизируют и просеивают, если зто необходимо, для того, чтобы удалить возможные агломераты, а затем ис- 40 пользуют для изготовления колонки.

После заполнения колонки и предварительного промывания буферными растворами 0,1 н. по НС8 или 0,05 М раствором цитрата с величиной рН 4, или 0,05 M раствором цитрата с величиной рН 6,8 или 0,1 н. раствором гидрата окиси натрия колонку приводят в состояние равновесия при помощи того же типа буферного раствора, который применяется при хроматограФии этого типа. Емкость колонки в отношении фиксации белков составляет величину порядка 40-200 мг/г, в зависимости от условий хроматографиро55 вания.

В этом примере декстран ДЕАЕ .может быть заменен другим аминированным полимерным полисахаридом, таким как крахмал ДЕАЕ.

Предложенный анионообменный материал применяют либо для избирательной фиксации биологических макромолекул,. которые желательно выделить или очистить, либо для избирательного задерживания примесей или других белков, присутствие которых является нежелательным.

Избирательная фиксация белков легко может быть достигнута путем регулироэания величины рН и полярности в соответствии с хорошо известными методами, применяемыми в области использования ионного обмена.

В том случае, когда материал фиксирует макромолекулы, которые желательно очистить или выделить, данные макромолекулы после этого элюируют раствором с подходящей величиной рН и полярностью.

В том случае; если материал задерживает примеси, биологические макромолекулы собирают непосредственно в растворе. После этого производят элкярование раствором с подходящими величинами рН и полярности для удаления примесей и производят регенерацию материала для последующего его использования.

Нижеследующие примеры подтверждают эффективность применения материала для очистки гамма-глобулинов из сыворотки людей или живстных; удаления гемоглобулина при процессе очистки альбумина из плацентарной крови и концентрации других белков; концентрирования разбавленного раствора белков в спиртовой среде и удаления спирта; концентрирования и очистки альбумина в растворе каприлата натрия; концентрирования и очистки ганглиозидов из водных экстрактов мозга, животных.

П р-и м е р 2. Проводят прямую очистку гамма-глобулинов из сыворотки или плазмы людей и животных, используя 50 г сорбента, приготовленного э соответствии с примером 1 по следующей схеме: сначала приводят колонки в состояние равновесия с буферным раствором с величиной рН, 6,8, например между 6,3 и 8 (буферный фосФатный раствор 0,01-0,02 М) или буферный раствор трис-НСГ, 0,05 или раствор хлористого натрия с концентрацией 1-3 г/л со скоростью

200 мл ° см /ч.

Затем вводят 50 мл плазмы или сыворотки, предварительно диализованных против буферного раствора, применяемого при хроматографировании, и профильтрованных (средняя скорость подачи 50-100 мл асм /ч) ° °

После этого промывают колонки буфеРным раствором, применяемым при хроматографировании.

Далее собирают Фракцию выходного пика, состоящего из чистых гамма-глобулинов, чистоту которых проверяют иммуноэлектрофорезом, с выходом, находящимся в интервале между 50 и 100%, в зависимости от применяемых буферных растворов. Выход является более высо,ким при величинах рН ниже, чем 6,8

867284 или при более высоких ионных силах, но при этом возникает опасность, что продукт будет йедостаточно чистым.

Такое получение гамма-глобулинов освобождает их от пирогенных веществ и от антигена, ассоциирующегося с гепатитом В (A НВ), которые могут присутствовать н сыром исходном материале, Затем элюируют другие белки, удерживаемые в колонке, каким-либо буферным раствором с величиной рН 4 или буферным раствором, применяемым при хроматографировании, с добавкой 1060 г/л хлористого натрия, или же цитратным буферным раствором 0,05 М с рН 4-8, Продолжительность цикла составляет примерно 2 ч и при применении простой автоматики, в один и тот же день можно провести десяток циклов, т.е. выход при обработке будет близок к 10 л сыворотки или 20 плазмы на 1 кг пористой неорганической окиси в день.

Пример 3. Проводят удаление, гемоглобина при очистке альбумина иэ плацентарной крови и концентрирование 25 других белков.

Исходный раствор готовят путем фракционирования плацентарной крови спиртом через стадию осаждения массы глобулинон при рН 6,8 в среде 20-25Ъ-ного зтанола. В этих условиях альбумин, некоторые альфа-1, альфа-2 глобулины и гемоглобин остаются в верхнем слое раствора. Их собирают путем центрифугирования на холоду, разбавляют равным объемом дистиллированной воды для того, чтобы снизить концентрацию спирта, величину рН устанавливают на уровне между б и 7 и жидкость осветляют путем фильтрования через мембраны из сложных эфирон 40 целлюлозы.

Схема цикла очистки на 50 r сорб.ен та .

Приводят колонки в равновесное состояние при помощи буферного фосфат-45 ного раствора 0,01 М или трис-НС8

0,05 М с величиной рН 6-7 (предпочтительно 6,5) при скорости подачи

200 мл-cM /÷.

Вводят при средней скорости пода-чи---100 -мл см1/ч 1000 мл описанного выше и подлежащего очистке раствора.

Промывают колонки буферным раство- ром, применяемым при хроматографии при той же скорости подачи. Очищенный гемоглобин удаляют из колонки при незначительной степени разбана ления, в то время- как другие белки, такие как альбумин, остаются фиксированными на колонке. бО

Элюируют белки, фиксированные на колонкв, в условиях идентичных приведенным в примере 2, причем пик содержит концентрированные белки, практически лишенные гемоглобина. 65

Продолжительность этого цикла составляет 4 ч, после которого можно сразу же начать новый, Пример 4. Проводят концентрирование раствора протеинов, разбавленных в спиртовой среде, и удаление спирта из 2Ъ раствора альбумина, содержащего 10Ъ этилового спирта, по следующей схеме (при использовании

1 кг сорбента) .

Сначала приводят колонки в состояние равнонесия при помощи 0,01 М фосфатного буферного раствора с рН 7 скорость подачи 200 мл см /ч. Затем вводят спиртовый раствор альбумина, величина рН которого установлена на уровне 7 путем прибавления соляной кислоты или гидрата окиси натрия, в зависимости от начальной величины рН, при средней скорости подачи

100 мл см /ч.

Таким способом на колонке фиксируют 200 r альбумина (либо 10 л раствора за цикл); если альбумин плохо фиксируется на колонке, следует разб.>вить исходный раствор дистиллированной водой для того, чтобы снизить ионную силу среды.

Затем колонку промывают дистиллированной водой со скоростью подачи

200 мл cM /ч и проверяют полноту удаления спирта.

Далее элюируют альбумин одним иэ следующих буферных растворов: 0,$, М раствором хлористого натрия или

0,05 М раствором цитрата с рН 6,8, при этом, как пранило, конечная концентрация альбумина составляет 1020Ъ, удаление спирта является полным, ныход при таком методе .равняется примерно 100Ъ. Этот способ применим для всех белкон, изоэлектрическая точка которых ниже,чем 6,5. В случае тех белков, изоэлектрическая точка которых превышает эту величину, метод применим при условии, что неличина рН буферного раствора, используемого при хроматографиронании, будет повышена.

Все примеси, присутствующие в этих белковых растворах, также могут быть удалены при условии, что они являются электрически нейтральными (глюциды и полисахариды) или имеют положительный заряд того же типа, что и сорбент. В случае примесей, имеющих отрицательный заряд, может произойти на сорбенте конкурен>ия с отрицательно заряженными белками, которые желательно фиксировать. В этом случае, если степень сродства примеси к сорбенту является меньшей, чем степень сродства белка, и если раствор может быть разбавлен в достаточной мере водой для достижения ионной силы, совместимой с фиксацией белков, на сорбенте можно произвести удаление аже катионов..

867284

Пример 5. Проводят к(цент- риронание и очистку альбумина в растворе каприлата натрия из раствора, содержащего 15 г/л альбумина и 3 г/л каприлата.

Схема цикла для 1 кг сорбента следующая.

Колонки приводят в равновесное состояние с фосфатным буферным раствором .0,01 М, РН 6 - скорость подачи 200 мл см1/ч, Вводят растворы альбумина и капри- 10 лата, величина РН которых установлена на уровне б (н случае черезмерно высокой ионной силы проводят разбавление водой) со средней скоростью подачи 100 мл см /ч. 15

Пропускают таким рбраэом через колонку примерно 8 л раствора, непрерывно контролируя фиксацию альбумина и выход каприлата натрия.

Затем промывают колонку буферным 20 раствором, используемым при хроматографии до тех пор, пока не прекратится.выход каких-либо веществ из колонки.

Также можно иммобилизировать раз.личные энзимы, что ведет к образова нию следующих материалов.с энзиматической активностью: пепсина, трипсина, хинотрипсина, плазмина, с -амино-. адипазы и т.д.

Наконец, предлагаемые материалы могут быть также использованы для иммобилизации молекул низкого моле-. кулярного веса, таких: как молекулы некоторых аминокислот, или некоторых лигандон, содержащих аминогруппы спиртов или тиоспиртов, или диэпокскд" ных соединений.

Так, например, возможно иммобилизировать лизин,и полученный материал может быть использован для очистки

Далее элюируют альбумин н соответ- д5 ствии с методом, изложенным в предшествующих примерах. При этом получают раствор, содержащий от 10 до

20% альбумина, который после того, как его концентрация будет доведена до 20%-ной, содержит меньше чем

2,5 г/л каприлата натрия . Общая продолжительность цикла состанляет примерно 4 ч. Из этого примера видно, что метод может быть распространен на очистку и концентрирование различных биологических молекул, имеющих биологические заряды при определенных величинах РН, например нуклеиновых кислот, белков, анионных полисахаридов. 40

Пример 6. Проводят концентрирование и очистку ганглиозидов из водных экстрактов мозга животных.

Ганглиозиды представляют собой гликолипиды,и в настоящее время биохимики изучают ту весьма важную роль, которую они играют в физиологии и в патологии на уровне клеточных .перегородок в качестве рецепторов и аффектоРов. Они содержат большее или мень- 5( шее количество сиалиновой кислоты и поэтому при величинах РН выше, чеЪ йримерно 3, заряжены отрицательно.

Из 1 кг бычьего мозга получают водный экстракт в количестве около

7 л. 55

Эти водные экстракты пропускают непосредственно через колонку, заполненную 50 г сорбента, приготовленного по способу, описанному в примере 1, .предварительно приведенно- 60 му в равновесное состояние"при помощи буферного раствора трис-НС3

0,05 м, РН 6,8. Скорость подачи составляет 200 мл см 1/ч. Все ганглиозиды в этих условиях фиксируются на колонке. Затем проводят предварительную промывку следующими растворами в указанной последовательности: трис-HCR О, 05 М, РН; О, 1. М раствором гидрата окиси натрия и водой.

После этого проводят основную про.вЂ” мывку хлороформом, метанолом и нодой в соответствующих объемных отношениях (30:60:25), что позволяет удалить. многочисленные примеси.

Далее элюируют ганглиозиды в концентрированной и очищенной ферме при той же скорости подачи, при помощи смеси: хлороформ-метанол вЂ” 0,1 н. со- ляная кислота н соответствующих объемных соотношениях (30:60:25) .

После элюирования собранный пик нейтрализуют путем прибавления 0,1 н. раствора гидрата окиси натрия, выларинают и растворяют в какой-либо хроматографической системе для анализа. Выход составляет 100%.

В данном разделении анионообменный материал, без какого-либе вреда для себя, может использоваться при много-. кратном переходе от органического растворителя к. нодному раствору и наоборот, что исключает необходимость стерилизации хроматографической колонки после каждого цикла.

Предлагаемый материал можно применять также при очистке антител или антигенон. . В этом случае проводят пропитку пористого неорганического носителя согласно изобретению иммобилизированным антигеном или антителом и используют модифицированный таким образом материал для очистки и концентрирования соответствующих антител и антигенов.

Так можно иммобилизировать альбумин,альфа-, бета- и гамма-глобулины лпбдей или животных.

Все бактериальные антигены и ядовитые антигены при величине РН 6,8 обладают отрицательными электрическими зарядами. Это имеет место для большинства белкон,полисахаридон и известных кулеиновых кислот, таких как гриппозный вирус,вирусы бешенства, чумы, оспы, аденовирус и т.д.

867284

Формула изобретения

Составитель В.Виноградова

Техред Ж.Кастелевич

Корректор Г.Огар

Редактор В.Иванова

Тираж 570 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР поделам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5

Заказ 8109/84

Филиал ППП Патент, r.yæãopîä, ул. Проектная, 4 или для удаления плазминогена или плазмина, белка крови, обладающего высокой степенью сродства по отношению к лизину.

Точно также можно иммобилизировать различные стероиды и использовать также материалы, уже модифицированные, для очистки их белком переноса. На конец, возможно иммобилиэировать различные клеточные рецепторы, например ганглиозиды, предварительно дезацетелированные для деблокирования наиболее реакционно способных аминогрупп и для того, чтобы использовать эти материалы для удаления, нейтрализации или очистки их лигандов.

Такий образом, предлагаемый анионообменный материал может найти самое широкое применение н хроматографическом разделении различных биологических макромолекул.

1. Лнионообменный материал для разделения биологических макромоле-,(5 кул, содержащий минеральный носитель . о и водорастворимое полимерное вещество, отличающийся тем, что, с целью улучшения физико-механических свойств и повышения обменной ЗО способности материала, в качестве но-. сителя он содержит макропористый водонерастворимый окисел, а в качестве ,водорастворимого полимерного вещестна вЂ” полисахаридные полимеры при сле- 35 дующем соотношении компонентов, нес %:

Полисахаридные полимеры 2,0-20,00

Неорганический окисел (Остальное ,;2. Анионообменный1 материал по п,1, отличающийся тем, что в качестве макропористого водонерастворимого окисла он содержит двуокись кремния анионного типа с удельной поверхностью 5-80 м /r u средним диаметром пор 50-1000 ммк.

3. Анионообменный материал Ilo пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве полисахаридных полимеров он содержит соединения с молекулярным весом 10 - 10 (дальтон, имеющих общую формулу

Р, R - (СН )-.И

2 где Р - остаток декстрана, крахмала, циллюлозы или агорозы; п - целое число от 1 до. 10 и Н,, R - одинаковые и различные радикалы - СНЪ| СН2СНЗФСН QEI, -(CH ) ОН или

QH -CHQH-CH °

4. Способ получения анионообменно"

ro материала по п.1 заключающийся в том, что макропористый водонерастворимый неорганический окисел пропитывают 1-10ъ-ным водным раствором полисахарида при рН 3-12 и затем сушат прп 40-120(С до постоянного веса.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

9 467883, кл. С 01 В 33/14,1972.

2. Патент Великобритании 9 1043616, кл. С1А, 1964.