Способ получения биологически активного вещества, обладающего способностью усиливать секрецию инсулина и улучшать глюкозную толерантность

Способ получения биологически активного вещества, обладающего способностью усиливать секрецию инсулина и улучшать глюкозную толерантность

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскик

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 310178 (21)2576599/28-13 (51) М. Кл.

3 (23) Приоритет— (32) 01.02.77 (31) 10397/77 (33) Япония

61 К 37/02

ЮС 12 N 1/04

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 07.10.81Бюллетень HP 37

Дата опубликования описания 07.10.81 (53) УДК 615.739. .6(088.8) Иностранцы

Мотоюки Ядзима, Конти Хосода, Чиканори Томиока и Мичио Уи (Япония) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма Какеньяку Како Кабусики Кайся ; (Япония) 3 (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО

BEI (ÅÑÒÂÀ, ОБЛАДАЮЩЕГО СПОСОБНОСТЬЮ

УСИЛИНАТЬ СЕКРЕЦИЮ ИНСУЛИНА И УЛУЧШАТЬ

ГЛЮКОЗНУЮ ТОЛЕРАНТНОСТЬ

1 2

Изобретение относится к микробио- логической промышленности и касается получения биологически активного вещества.

Предлагаемый способ новый, в патентной и научно-технической литературе не описан. Целью изобретения является получение биологически активного вещест- 10 ва, обладающего способностью усиливать секрецию инсулина и улучшать глюкоз йую толерантность .

Это достигается тем, что патогенный штамм Bordete88a pertussis вы- )5 ращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и стимуляторы роста с последующим выделением из культуральной жидкости белковой фракции с мо- 20 лекулярным весом 77000+6400, определяемым с помощью гель-фильтрации и очисткой целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом. 25

Патогенный штамм Bordete6 a pertussis выращивают в твердой или жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минераль-. ные соли и стимуляторы роста. 30

Собирание и очистку биологически активного вещества от питательной среды производят любым из известных методов, например, осаждением1 хроматографическим разделением, применением молекулярного сита, электрофоретическим методом и т.д., причем эти методы осуществляют отдельно, а также в соответствующих сочетаниях..

Метод хроматографического разделения в колонке является наиболее эффективным, в соответствии с ним верхний слой питательной среды пропускают через колонку, которая содержит наполнитель, например, продукт гидроксиапатиит, CM-Сефароз Cl-6Â или

Сопл — Сефароз — яь.

Действующее вещество адсорбируется в этих колонках с высокой селективностью, после чего его вымывают подобранным элюентом, например, 0,1 М фосфатным буфером с величиной рН 7,0, содержащим 0,5 М хлорида натрия. После чего очищенный продукт подвергают диализу для освобождения ненужных солей, вследс:вие чего получают биологически активное вещество.

Применяют также метод аммонитсульфатного осаждения. Для этого в верхний слой питательной среды добавляют

871721 твердый сульфат аммония до достижения. такой точки, которая приближается к точке насыщения растворенной солью, а величину рН доводят до 6=7 добавлением разбавленного водного раствора аммиака. Затем осадок промывают водой, а биологически активное вещество экстрагируют иэ него 0,1 М раствором трис-буфера с величиной рН 8,0, содержащим 0,5 М хлорида натрия.

Полученное биологически активное вещество представляет собой не расплывающийся белый или светло-коричневый продукт, который растворяется в воде при комнатной температуре в концентрации от 3 до 5 мг/мл. При попадании в 6 н.раствор соляной кислоты он образует нерастворимый белый осадок. Он растворим в пиридине, додецилсульфате натрия, 2-мер ..аптоэтайоле и цистиновом растворе. Добавление смеси сухого льда с ацетоном или этанолом, трифторуксусной кислоты или раствора-хлористого цинка, или раствора, содержащего металлические ионы некоторых металлов в раствор очищенного биологиЧески активного вещества на холоду (при 4 C) приводит к образованию мутно-белого осадка. При попадании в смешанный раствор воды и хлороформа или н-бутанола биологически активное вещество не рас"гворяется и в таком растворе собирается вокруг поверхности раздела между двумя жидкостями °

При нагревании водного раствора вещества до 80 С или выше оно становится мутно-белым. При растворении вещества в 0,1 N фосфатном буфере (при рН 7,0), содержащем 0,5 N хлористый натрий при проведении диалиэа с использованием дистиллированной воды в качестве внешней жидкости, вещество временно становится мутнобелым, а если диализ продолжать дальше, то вещество вновь полностью растворяется. Если высококонцентрированный раствор подвергают тщательному диалиэу с использованием 0,01 М ацетатного буфера (pH-4,5.), то это вещество приобретает светло-коричневую окраску и растворяется. Молекулярный вес вещества 77000 6400 определен фильтрованием геля через колонку с Биогелем P-100, уравновешенным 0,1 М фосфатным буфером, который содержит 0,5 М хлористый натрий.

Содержание белка превышает

95 вес.Ъ,а содержание сахарина составляет 1 вес.Ъ.Концентрация липида ниже минимально определяемого предела.

Биологически активное вещество усиливает секрецию инсулина и оказывает улучшающее действие на поддержание уровня глюкозы, причем эти действия сохраняются в течение от нескольких недель до нескольких месяцев после принятые одинаковой дозы. Острая токсичность L Dgo — 200 мг/кг живого веса.

H p и м е р 1. Получение биологически активного вещества. Лиофилизованный и консервированный микроорганизм BordeteN à pertussis подвергают культивированию в чашках с использованием среды Борде-Жангу при температуре 37 С в течение 2 дней, а затем с помощью платиновой петли осуществляют инокулирование указанными бактериями в 500-миллилитровой колбе для встряхивания, содержащей 200 мп ионообменной смолы, модифицированной средой Коен-Веелера

15 (среда КВ), состав которой приведен в табл. 1, добавленной с помощью пипетки, после чего проводят процесс культивирования встряхиванием в течение от 20 до 24 ч при температуре щ 37 С. Концентрацию бактерий в питательном растворе измеряют с помощью спектрофотометра (с длиной волны

650 пт); этот раствор добавляют в двухлитровую колбу для культивирования встряхиванием, в которую добавляют с помощью пипетки 1 л ионообменной смолы совместно с введенной в нее средой КВ, вследствие чего конечная концентрация бактерий равна приблизительно 0,1х10 кле ок/мп, а затем проводят процесс культивирования встряхиванием в течение 48 ч (частота встряхивания составляла

97 циклов/мин при температуре 37 С) °

При использовании этой жидкой среды ее добавляют совместно с дистиллированной водой, взятой в количестве, достаточном для доведения общего объема до 1000 мл, а после доведения величины рН до 7,2 до40 бавления 203-ного раствора гидрата окиси натрия в раствор среды дополнительно добавляют 3 г анионообменной смолы, а затем всю смесь подвергают обработке в автоклаве при тем45 пературе 121 С в течение 15 мин.

Приготовленный после 48-часового встряхивания раствор с культурой подвергают выдержке при температере

56ОC в течение 30 мин, а затем центрифугированию (при скорости вращения 15000 об/мин) при температуре 4 С с целью отделения верхнего слоя и бактериальной клеточной массы, после чего полученный таким образом верхний слой раствора среды используют в качестве исходного материала для очистки и выделения целевого активно действующего вещества.

10 л этого верхнего слоя после доведения рН до 6,0 добавлением 1 н.

60 раствора соляной кислоты вводят в гидроксилапатитную колонку (2,5х4 см)

При расходе потока 200 мл/ч на первой стадии очистки.

Большая часть белка проходит че65 рез колонку беэ адсорбции в ней, и

871721

Степень чистоты вещества определяют в соответствии с методом дискового электрофореза с использованием полиакриламидного геля (полиакриламидная концентрация — 7,5%, буфер

1 н. гидрат окиси калия - ледяная уксусная кислота с рН.4,3).

Количество образца на гель составляет 30 мкг (в пересчете на белок), причем эксперимент проводят с приложением тока величиной 4мА в течение

2 ч, с образованием пятен амидной черни 10 В и удалением пятен с использованием 7%-ного раствора уксусной кислоты. Образец, полученный на этой последней стадии, представляет собой единственное вещество, которое совершенно свободно от примесей, а активность в отношении ускорения секреции инсулина, которую определяют в ходе проведения эксперимента, соответствует активности выделенного вещества. Для установления подробного строения биологически активного вещества его подвергают последующему

НДС (натрийдодецилсульфатному) полиакриламидному гелевому электрофорезу.

Образец биологически активного вещества в количестве 50 мкг/пробирку (в пересчете на белок) добавляют в смесь 1% НДС, 1% 2-меркаптоэтанола и 4 моль мочевины, а после двухчасовой инкубации при температуре 37" С эту смесь помещают в 10%-ный полиакриламидный гель, который содержит

1% НДС. Затем, после ч .тырехчасового пропускания тока 8мА/гель, получают пятна с использованием Сообразя голубого с последующим удалением пятен

7,5%-ной уксусной кислотой.

60 целевую секреторную инсулиновую активность определяют с трудом. Концентрацию белка измеряют по методу

Лоури.

Для определения адсорбированных веществ колонку вначале промывают

0,01 М фосфатным буфером (при рН 5

6,0),„ а затем (после повышения молярной концентрации фосфатного буфера до 0,1 и рН до 7,0) элюируют адсорбированные елки. Однако в этих условиях не элюируют целевое биологически активное вещество. Дополнительное элюирование осуществляют с использованием фосфатного буфера того же самого состава, но содержащего 0,5 М хлорида натрия.

В этих условиях целевое вещество может быть выделено с высокой эффективностью в соответствии с элюированным белком.

Полученное биологически активное 20 вещество концентрируют и после его помещения в диализную мембрану с максимальным молекулярным весом для проникающих молекул 8000 дважды проводят диализ (в общей сложности в тече- 25 ние 12 ч) с использованием дистиллированной воды и дважды (в общей сложности в течение 12 ч) с использованием 0,01 М Фосфатного буфера (с рН 6,0). Для дальнейшей очистки раст- 30 вор, содержащий диализированное биологически активное вещество, пропускают через колонку (1,5х10 см) с карбоксиметилсефарозой С(,-6В, уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером (с рН 6,0), Продукты, которые не были

35 адсорбированы в этой колонке, не проявляют никакой активности. Затем, после повышения молярной концентрации и рН фосфатного буфера соответственно до 0,1 и 7,0, аналогичное элюиро- 40 ванне осуществляют добавлением 0,5 М соли, в результате чего получают целевое биологически активное вещество, которое согласовывалось с элюированным белком. 45

Так как этот продукт все еще содержит небольшое количество примесей в дисковом электрофоретическом направлении, это вещество подвергают дальнейшему концентрированию, а пос- 50 ле помещения в диализную мембрану дважды диализируют (в общей сложности в течение 12 ч) с использованием дистиллированной воды и дважды (в общей сложности в течение 12 ч) с использованием 0,01 М фосфатного буфера (с рН 7,0), а затем диализированный образец пропускают через колонку (1,5х8 см) с Кона- сефароэой

4В, которую уравновешивают 0,01 М фосфатным буфером (с рН 7,0).

В результате проявления тем же саьым буфером элюируют незначительные следы белка, однако этот белковый компонент не обладает никакой активностью. Дальнейшее элюирование; 65

0,1 М фосфатным буфером (c pH 7 0) содержащим 0,5 М хлористого натрия, позволяет получить вещество, кото- рое соответствует элюированному белку.

Поскольку эта часть все еще содержит незначительное количество примесей в дисковом электрофоретическом направлении, такой белковый компонент собирают, конденсируют и подвергают диалиэу с использованием

0„l М фосфатного буфера (с рН 7,0), который содержит 0,5 М хлористого натрия, после чего диализированный образец подвергают гелевому фильтрованию пропусканием через колонку (2,8х60 см) с Виогелем F-100, уравновешенным тем же самим буфером.

В результате этого получают чистое биологически активное вещество, которое соответствует белковому компоненту, характеризовавшемуся наличием пика на уровне молекулярного веса приблизительно 80000.

В табл. 2 представлены данные, характеризующие степень очистки препарата.

871721

Пример 2. Лиофилизованный и консервированный микроорганизм

BordeteKPa pertussis (штамм Р 1Н

114/3779В/) подвергают культивированию встряхиванием с лоследующим выделением по аналогии примера l, в результате чего получают 10 л поверхностного слоя культуры в жидкой среде.

Полученный таким образом поверхностный слой далее разделяют на две части, одну из которых пропускают через колонку с гидроксиапатитом (2,5х4 см) с расходом потока 200 мл/ч после доведения величины РН поверхностного слоя до 6,0 добавлением 1 н. соляной кислоты. Эту колонку промывают водой, а затем адсорбированное вещество элюируют 0,1 M ,фосфатным буфером, который содержит

0,5 М хлористого натрия (с величиной

РН 7,0).

Полученный таким образом элюат помещают в диализную мембрану с проницаемостью для веществ максимального молекулярного веса 8000 и трижды проводят диализ с использованием дистиллированной воды (в общей сложности в течение 18 ч), в результате чего получают биологически активное вещество. После -этого полученное вещества подвергают обработке сушкой с вымораживанием, вследствие чего получают тонкодисперсный порошкооб- разный белок коричневато-белого цвета, который ускоряет секрецию инсулина.

В другие 5 л поверхностного слоя культуры в жидкой среде добавляют до 90%-ной степени насыщения сульфат аммония (доведя РН до 6,5 добавлением слабого водного раствора аммиака), -в результате чего все белковые вещества выпадают s осадок. Затем осадок полностью промывают водой и подвергают выщелачиванию буфером

0,1 М трио-0,5 хлористого натрия (с величиной РН 9) с получением экстракт ного раствора. Этот приготовленный экстрактный раствор вначале нейтрализуют 1 н. раствором соляной кислоты, а затем подвергают трехкратному диализу (в общей сложности в течение, 18 ч) с использованием дистиллированной воды и вышеупомянутой диализной мембраны для получения биологичес ки активного вещества, в результате чего получили 11,2 мг высушенного вымораживанием порошка (образец В).

Пример 3. С использованием лиофилизованного и консервированного микроорганизма Bordetella pertussis (штамм Маепо, фаза 1) повторяют эксперимент, описанный в примере 1, в результате чего получают 23,6 мг и 10,8 мг каждого иэ лиофилизованных порошкообразных образцов биологическ активных веществ (образцы С и Д).

Удельная активность каждого образца приведена в табл. 3.

Острая токсичность (i Р 0 ) для каждого образца при внутривенном введении мышам приведена в табл. 4.

Таким образом, порошкообраэные образцы биологически активных веществ могут быть использованы в качестве лекарственных или профилактических средств при диабетах, причем их эффективная дозировка находится в интервале 1-100 мкг/кг живого веса.

Пример 4. Микроорганизм

Вогде еИ à pertussis (штамм Тояма, фаза 1) подвергают культивированию по.аналогии примера 1, а верхний

15 слой культуры в жидкой среде, приготовленный выделением иэ микроорганизма, используют в качестве исходного материала. Ацетон, который предварительно охлаждают сухим льдом, по кап;@.лям добавляют в 100 л встряхиваемого поверхностного слоя с охлаждением сухим льдом до конечной концентрации

60%. После этого осадок собирают с помощью сепараторной центрифуги непрерывного действия (скорость вращения — 5000 об/мин, температура 4 С). .Полученный таким образом остаток высушивают с получением продукта, который растворяют в 500 мл 0,0.1 М () фосфатного буфера (с РН 6,%) а затем пропускают через колонку (5х4 см) с гидроксилапатитом. Биологически активное вещество накоплено в компоненте, который элюируют 0,1 M

35 Фосфатн буФером (с рн 7 О) содержащим 0,5 М хлористого натрия.

Элюированное.вещество собирают, конденсируют и подвергают диалиэу с использованием 0,01 М фосфатного буфеРа (с РН 6,0), а затем пропускают

40 через колонку с CM- Сефарозой CL-6B (2,5х25 см), которую уравновешивают тем же самым буфером, а биологически активное вещество элюируют 0,1 М

Фосфатным буфером, содержащим 0,5 М

-4 хлоРистого натрия. В дальнейшем биологически активное вещество,элюированное таким образом, собирают, конденсируют и подвергают диализу с использованием 0,1 М фосфатного буфера (с РН 7,0),содержавшего 0,5 M . хлористого натрия. После этого вещество помещают в колонку с Биогелем

Р-150 (2xl05 см), который уравновешивают 0,1 М фосфатным буфером, содержащим 0,5 М хлористого натрия и

4 М мочевины. Это биологически активное вещество представляет собой белок, который характеризуется нали-. чием пика для молекулярного веса приблизительно 80000, причем полуфО чают 38 мг его лиофилиэованного порошка. Полученный таким образом продукт характеризуется нижеследующим химическим составом: 95 вес.Ф и больи ше белка, 1-2 вес.Ъ углеводов, при65 чем не обнаружено никакого лицида.

871721

Удельная активность продукта составляет 930 ед/мкг.

Пример 5. Лиофилизованный и консервированный микроорганизм

BordetefLà pertussis (штамм Тояма, фаза 1) подвергают культивированию встряхиванием по аналогии с изложенным в примере 4, а выделением бактериальной клеточной массы из культуры в жидкой среде получают 100 л поверхностного слоя. В полученный поверхностный слой добавляют 50%-ного водного раствора хлористого цинка со встряхиванием при комнатной температуре до доведения величины рН до

6,0 (конечная концентрация 1%). Этот осадок растворяют в 10%-ном вторичном фосфате натрия, а затем помещают s диализную мембрану, подвергают диализу с использованием воды с последующим уравновешиванием 0,01 М фосфатным буфером. Затем этот раст- 20 вор пропускают через колонку (10x5 см) с гидроксилапатитом, после чего промывают 0,1 М фосфатным буфером (с рН 7,0) с последующим элюированием

0,1 М фосфатным буфером, содержавшим 25

0,5 М хлористого натрия. Полученный элюат конденсируют и пропускают через колонку (2,5x100 см) с Сефакрилом

$-200, а затем элюируют 0,1 М с фосфатным буфером (с рН 7,0), который содержит 0,5 М хлористого натрия и

4 М мочевины. После этого проводят гелевое фильтрование с получением биологически активного вещества.

Молекулярный вес полученного вещества равен приблизительно 7200 (с помощью гелевого фильтрования), причем получают 40 мг сухого порошка. Полученный продукт характеризуется нижеследующим химическим составом: приблизительно 95 вес.Ъ или больше 40 белка, 1-2 вес.Ъ углеводов, причем не было обнаружено никакого липида.

Удельная активность составляла

890 ед/мкг.

Пример б. Микроорганизм 45

Bordetetta pertussis (штамм Тояма, фаза 1) подвергают культивированию в среде БордЕ-Жангу при температуре

37 С в течение 2 дней, а затем в скошенной среде Борде-Жангу при темпера- 50 туре 37 С в течение 20-24 С, после чего с помощью платиновой петли указанными бактериями инокулируют модифицированную твердую среду Коен-Веелера с добавленным в нее древесного угля (среда КВ), состав которой приведен в табл. 5, с последующим культивированием в течение 48 ч при температуре 37 С. 5 кг полученной влажной бактериальной клеточной массы суспендируют в 5 л дистиллированной воды 60 и выдерживают в ней при температуре

56 С в течение 1 ч.

После охлаждения в суспензию добавляют Ь1тегоза6 до достижения ее конечной концентрации 0,013 и ее 65 подвергают центрифугированию (скорость вращения 15000 об/мин) в течение 30 мин для отделения бактериальной клеточной массы. Собранную клеточную массу суспендируют в дистиллированной воде, которая содержит 4 моль мочевины и 1 моль хлористого натрия, а затем подвергают обработке в ультразвуковом оборудовании при низкой температуре (4 С) для уничтожения. живых клеток бактерий.

Полученную суспензию подвергают .центрифугированию (при скорости вращения 15000 об/мин) в течение 30 мин, а не содержащий осадка поверхностный слой подвергают диализу с использованием воды с последующим уравновешиванием 0,1 М фосфатным буфером (с рН О,б), после чего пропускают через колонку (10x5 см) с гидроксилапатитом. После выьывания адсорбированных ,примесей 0,01 M фосфатным буфером (с рН 0,6) и 0,1 М фосфатным буфером (с рН 7,.0) целевое вещество элюируют

0,1 М фосфатным буфером (с рН 7,0), который содержит 0,5 М хлористого натрия.

Полученное таким образом биологически активное вещество уравновешивают 0,01 М фосфатным буфером (с рН 6,0), а затем пропускают через колонку (2,5х30 см) c CN-Сефарозой

CL-6B. Эту колонку вначале промывают

0,05 М фосфатным буфером с рН 6,0, а затем элюируют 0,1 М фосфатным буфером (с рН 7,0), который содержит 0,5 M хлористого натрия, с элюированием биологически активного вещества. Затем это элюированное вещество конденсирузт и растворяют в 0,1 M фосфатном буфере (с рН 7,1), который содержит 4 М мочевины и

0,5 М хлористого натрия, после чего пропускают через колонку (2,5х115 см) с Сефакрилом $-200.

После этой операции проводят элюирование растворителем с получением 40 мг целевого вещества.

На основании результатоs из:,: рений путем гелевого фильтрования вычисляют, что молекулярный вес равен 74000, причем продукт характеризуется нижеследующим химическим составом: свыше 95 вес.о обелка, 2 вес..З углеводов, причем не было обнаружено никакого липида. Удельная активность составляет 920 ед/мкг.

Состав среды КВ приведен в табл.5. (При использовании. этой твердой среды ее растворяют нагреванием после доведения величины рН до 7,2, а затем в среду добавляют 5 г порошкообразного древесного угля и подвергают ее обработке в автоклаве при температуре 121 С в т"чение 20 мин).

В качестве эффективного получения биологически активного вещества могут быть различные хроматографические обработки. Осуществление такого

871721

12 метода при его соответствующем включении в последовательный ряд операций процесса получения, как это описано в примере 1, позволяет частично исключить стадии получения-. В дальнейшем как очистку, так и получение при осуществлении такого метода проводят по аналогии с тем, как это изложено в примере 1. Этот метод изложен более подробно ниже.

Пример 7 ° Лиофилизованный и консервированный микроорганизм

Вогде еИа p rtussis (штамм Тояма, фаза 1) подвергают культивированию (как описано в примере 1). 10 л полученного поверхностного слоя культуры в жидкой среде пропускают через 15 колонку (размеры колонки 5х2 см, расход потока материала 60 мл/ч) с

„-гидроксилапатитом, а затем промывают

300 мл 0,01 М фосфатного буфера (с рН 7,0). После этого через нее про- Щ пускают 0,1 М фосфатный буфер (с рН 7,0), который содержит 0,5 N хлористого натрия, с расходом потока

15 мл/ч, с целью элюировать биологически активное вещество. Полученное вещество конденсируют до объема примерно 15 мп с использованием продукта Фикол-400 с последующим его четырехкратным диализом в общей сложности. в течение 24-часового промежут- З ка времени с использованием 2 л дистиллированной воды, а затем его под» вергают вновь четырехкратному диализу в течение в общей сложности 24-часового промежутка времени с использованием 1 л 0,01 N ацетатного буфера (с рН 4,5), который содержит 0,1 М хлорида натрия или 0,1 M хлорида лития-хлористого водорода (с рН 4,5) для уравновешивания ° Этот продукт пропускают через колонку с и -ацеток- 40 сиртутьанилин-Сефароэой 6МВ (размеры колонки 1,2х8 см), которую уравновешивают тем же самым буфером, что упомянут выше, с расходом потока 5 мл/ч, а после тщательной промывки тем же самым буфером адсорбированное вещество элюируют тем же самым буфером, к которому добавляют 0,01 M L -цистеина.

Полученное вещество собирают, а затем кондвнсируют до объема приблизительно ()

5 мл .с помощью продукта Фикол-100 с пОследующим трехкратным диализом в общей сложности в течение 12-часового периода с использованием 0,1 М фосфатного буфера (с рН 7,0) в количестве 2 л, который содержит 4 моль мочевины и 0,5 моль хлористого натрия для уравновешивания, после чего его подвергают дальнейшему уравновешиванию с использованием того же самого буфера. Гелевое фильтрова- bQ ние осуществляют в колонке с Сефакрилом S-200 (2,8х95 см).

Биологически активное вещество получают в виде продукта с одним пиком молекулярного веса 65000 7000 65 (как это в дальнейшем определяют по истечению эталонного белка), совпадающим с пиком активности °, Это вещество подвергают диализу (с использованием 2 л дистиллированной воды, 5 раз в течение в общей сложности 48 ч), а затем лиофилизируют с получением 2,1 мг белого порошка.

Этот продукт характеризуется единственной полосой при полиакриламидном гелевом электрофорезе (с рН геля 4,8) и нижеследующим химическим составом: свыше 98 вес.Ъ белка, причем не было обнаружено ни углеводов, ни липида.

Пример 8. Лиофилизованный и консервированный микроорганизм

Bordete60 à pertussis (штамм Тояма, фаза 1), подвергают культивированию (как в примере 1), а затем 10 л полученного таким образом поверхностного слоя культуры в жидкой среде пропускают через колонку (колонка с размерами 5х2 см, расход потока

60 мл/ч) с гидроксилапатитом с последующей промывкой 300 мл 0,01 M фосфатного буфера (с рН 7,0), после чего через колонку пропускают 0,1 М фосфатный буфер (с рН 7,0) при расходе потока 15 мл/ч.

Полученное активнодействующее вещество конденсируют до объема 15 мл с помощью продукта Фикол-400, а затем подвергают. четырехкратному диализу в течение 24-часового периода с использованием 2 л дистиллированной воды с последующим четырехкратным диализом в течение в общем 24-часового промежутка времени с использованием 1 л 0,01 М фосфатного буфера (с рН 7,0) для уравновешивания.

Биологически активное вещество пропускают через колонку с анти-БАО-антитело-Сефароэой 4В (колонка с размерами 1,8х13 cM), а затем тщательно промывают приблизительно 20 мл

0,01 М фосфатного буфера (с величи.ной рН 7,0), который содержит 0,1 M хлористого натрия, с последующим элюированием 0,1 М глицин-хлористого водорода (с рН 3,0), который содержит 2 ммоль ЭДТК и 0,15 М хлористого натрия, с расходом потока 60 мл/ч.

Элюат сразу нейтрализуют 1 М глициновым буфером (с рН 11,5).

Биологически активное вещество собирают и подвергают трехкратному диализу в общей сложности в течение

48 ч с использованием 5 л дистиллированной воды с получением 1,9 мг белого порошка.

Молекулярный вес этого вещества составляет 70000+5000 с получением единственной полосы при полиакриламидном гелевом электрофорезе (гель с рН 4,3). Продукт характеризуется следующим химическим составом:

97 вес ° Ъ или больше белка, 1Ъ или

87172 1

l4 менее углеводов, причем не обнаружено никакого липида.

Пример 9. Фармакологическое действие белкового биологически активного вещества.

Определение способности ускорять секрецию инсулина.

Способность повышать скорость секреции инсулина у биологически активного вещества можно определить по реакции животного на стимуляторы секреции инсулина различных типов, причем обычно в качестве стимулятора для этой цели используют глюкозу.

Подопытные животные.

Самцы крыс Wiatar .(с весом от 130 до 140 r) .

Ррубо очищенные или очищенные биологически активные вещества различной силы растворяют в физиологическом солевом растворе и внутривенно вводят по 0,2 мп каждого из этих растворов под эфирной анестезией в бедренную вену подопытной крысы, после чего по истечении трех дней измеpHIoT для каждого вещества секреторную инсулиновую активность. За 18-20 ч до начала эксперимента крыс привязывают. Для измерения активности из г концентрация инсулина в плазме после введения глюкозы (мкед/мп)

1 /G (мкед/мг) Концентрация глюкозы в крови после введения глюкозы (мг/мл) 40

Средняя величина соотношения 6I/дС для животных, в организм которых вводят экспериментальные вещества

Средняя величина соотношения Ь I/д6 для животных контрольной группы

Единица х .100

Средняя величина 35,1/äG для контрольной группы

Это вещество позволяет ускорять секрецию инсулина, однако оно обладает также другими фармакологнчески полезными свойствами, в частности улучшенной глюкозной толерантностью, улучшенной реакцией, состоящей в секреции инсулина, ускоренным лечением диабета, вызываемого стрептозотоцином и улучшенной глюкозной толерантностью при наследственном диабете. Это действие сохраняется в течение от несЩ кольких недель до нескольких месяцев при единовременном введении в организм такого вещества. Это наблюдали у всех подопытных животных, включая .

* мышей, крыс и собак, фармакологическое действие такого вещества не

Использование содержания глюкозы в крови для расчета активности обусловлено той причиной, что количестI во. секретируемого инсулина в значительной степени определяется содержанием в крови сахара.

Удельную активность для каждого вещества получают делением единицы на количество белка (метод Лоури и др.).

Единица и дозировка (в пересчете на белок) биологически .активного вещества, полученного по примеру

1, указаны в табл. б.

Образец очищенного биологически активного вещества показывает сигмоидную.связь между реакцией и дозировкой, однако для расчета в единице и стадии очистки как для вещества, так и для его эквивалента был выбран максимально возможно линейный участок. хвостовой вены каждой крысы отбирают по 0,1 мл крови, непосредственно после чего внутрибрюшинно вводят 30%ный глюкозный раствор в количестве

1 мл на каждые 100 r веса тела и точно по истечении.15 мин после этого по аналогии с вышеизложенным вновь отбирают по 0,1 мл крови. Секреторную инсулиновую активность определяют по разнице содержания глюкозы в крови и по концентрации в крови инсулина перед введением глюкозы и после введения глюкозы. Концентрацию глюкозы в крови измеряют согласно глюкозоксидазному методу, а концентрацию инсулина измеряют по двойному методу ан15 тител.

Парентеральный раствор для внутривенного введения, используемай для последующего фармакологического эксперимента, готовят в соответствии

20 с вышеприведенным составом.

Методика расчета инсулиновой секреторной активности. Вначале величины соотношений аЕ/д6 активнодействующего вещества для группы животных, в 5 организм которых его вводят, и для контрольной группы животных получают с помощью следующего уравнения:

Концентрация инсулина в плазме перед введением глюкозы (мкед/мл) Концентрация глюкозы в крови перед введением глюкозы (мг/мп)

Единицу для каждого активнодействующего вещества можно получить с помощью нижеследующего уровнения:

871721

16 изменяется в сколько-нибудь сущест.венной степени в зависимбсти от различий видов животных.

Вещество находит применение в качестве средства для лечения диабе тов. В настоящее время процесс лечения диабетов зависит от инъекции инсулина или введения через рот анти, диабетических лекарственных препаратов, однако при этом лечение является просто симптоматическим, и (как считается в настоящее время) диабеты можно назвать неизлечиваям заболеванием. Более того, пациент вынужден ежедневно приходить в больницу для инъекции инсулина, причем в этих случаях введение антидиабетических лекарственных препаратов всегда сопряжено с опасностью вызвать ненормальное отклонение содержания глюкозы в крови от необходимого 20 уровня. Достоинство этого вещества состоит в том, что оно не только само по себе обладает исключительно ценным действием, вызывающим секрецию инсулина, но также характеризу-,25 ется действием, вызывающим повышение концентрации инсулина в крови ° только тогда, когда содержание глюкозы в крови в определенных условиях повышаетая (гипергликемическое состояние, ЗО в особенности при попадании в организм глюкозы, в частности, при приеме пищи), вследствие чего содержание глюкозы в крови быстро возвращается от повышенного к нормальному уровню, кроме того, его действие сохраняется s течение промежутка времени от нескольких недель до нескольких месяцев после единовременного введения в организм. Таким образом, в том случае, когда секреторная 40 инсулиновая Реакция на уровень глюко-. зы в крови отклоняется, введение этого вещества в организм приводит к нормальной инсулиновой секреторной активности. Благодаря таким свойст- 45 вам это вещество находит более широкое применение, т.е. оно является полезным не только в качестве лекарственного средства для лечения диабета, его осложнений и старчес- 5( ких заболеваний, порожденных диабетами, но также оказывается эффективным в применении на преддиабетических стадиях заболевания илйв качестве профилактического средства, лечебного или диагностического средства на начальной стадии диабета, для которой все еще отсутствуют лекарственные средства.

Действие ускоряющее инсулиновую секрецию, предлагаемого биологически 60 активного вещества быЛо испытано на крысах-(самцы крыс штамна Wistar) и собаках (как на самцах, так и самках собак породы ищейка илй коротконогая гончая собака) ° 65

При введении крысам глюкозы, которая является наиболее физиологическим фактором, наблюдали заметное повышение концентрации инсулина в крови по сравнению с тем, что имеет место в контрольной группе животных независимо от пути введения глюкозы в организм. Было также отмечено заметное повышение реакционной способности в отношении стимуляторов гор» мона,,в частности глюкогона (1 мг/кг) и эпинефрина (200 мкг/кг). Наблюдали также повышение инсулиновой секреторной активности толбутамида (20 мг/кг) и глибенкламида (мг/кг), которые в настоящее время используют в качестве клинических антидиабетических средств. На основании этих результатов было установлено, что ввецение в организм предлагаемого вещества позволяет заметно улучшить реакционную способность организма на попадание в него стимуляторов инсулиновой секреции.

Данные стимулирования реакционной способности в отношении различных стимуляторов инсулиновой секреции . в организме крыс, которым предварительно ввели биологически активное вещество, приведены в табл. 7.

1 мкг вещества вводят внутривенно за 3 дня до начала эксперимента.

В вышеприведенной таблице представлены средние величины и стандартные погрешности (СП) для 5 животных.

Биологически активные вещества были введены внутривенно собакам и спустя 3 дня для проверки способности стимулировать инсулиновую секрецию в их организм вводили глюкагон (внутривенной инъекцией в дозировке

25 мкг/кг живого веса). За 18 ч до начала эксперимента подопытных животных привязали.

Экспериментальные результаты для введения глюкагона приведены в табл.8.

Ускорение, хотя и незначительное, инсулиновой секреции отметили по сравнению с контрольными животными в течение 5 мин после введения глюкагона в дозировке 50 nr (в пересчете на белок)у то же самое во всех остальных случаях, на килограмм живого веса, причем инсулиновая секреция ускорялась пропорционально увеличению дозировки, достигая практически максимальной степени реакции при дозировке 1 мкг/кг. Аналогичную способность усиливать инсулиновую секреторную активность отметили при., введении глюкозы {через рот или внутривенной ииъекцией), а также при введении эпйиефрииа (см. табл. 9) .

Эти результаты показывают, что при введении вещества у собак также на-, блюдается заметное повьиаение реакционной способности в отношении стимуляторов инсулиновой секреции.

17

871721

Данные об усилении инсулиновой секреции после введения глюкагона в организм собак, которым предварительно ввели биологически активное вещество ВАВ, приведены в табл. 8.

Данные об усилении инсулиновой секреции после введения глюкозы и эпинефрина через 5 мин после внутривенного введения инъекцией в организм собак, которым предварительно ввели

BAB приведены в табл. 9. Действие в отношении улучшения глюкозной толерантности.

Глюкозу вводили через рот крысам ,и собакам и производили измерения снижения содержания глюкозы и концентрации инсулина в крови животных для определения глюкоэной толерантности. Глюкозу крысам давали в дозировке 0,5 г/100 г живого веса (крысы). и собакам в дозировке 15 г/животное, причем животных предварительно за 18-20 ч до начала эксперимента привязали.

В организме крыс и собак, которым предварительно ввели SAB рост кон- центрации глюкозы в крови заметно подавлялся при одновременном повышении содержания инсулина в крови, однако эта концентрация инсулина быстро вернулась до того уровня, на котором она находилась до введения в организм глюкозы, в соответствии с нор