Штаммы е.coli вниигенетика vl 334 @ n6 и вниигенетика vl 334 @ n7-продуценты l-треонина и способ их получения

Штаммы е.coli вниигенетика vl 334 @ n6 и вниигенетика vl 334 @ n7-продуценты l-треонина и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 30.06.78 (21) 2639616/30-15 (i и 875663

Союз Соеетских

Социалистических

Республик (51) М. Кл.з

А 23К 1/22

С 12N 13/00 с присоединением заявки № (43) Опубликовано 15.09.82. Бюллетень № 34 (45) Дата опубликования описания 15.09.82. (53) УДК 636,085.57 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения В. Г. Дебабов, Ю. И. Козлов, Н. И.

Н. К. Янковский, М. Н. Розинов, Б. А.

В. А. Лившиц, М. М. Гусятииер, С. В. МЛ. Ф. Козырева и P. А.

Всесоюзный научно-исследовательски селекции промышленных ми

«В Н И И генетика (71) Заявитель (54) ШТАММЫ E. COLI ВНИИГенетика Ч1.334рУ Эй 6

И В Н И И Генетика Ч 1.334рУ7 — П РОДУЦЕ НТЪ|

L-ТРЕОНИНА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

f6c ÀèiIñòÂÎííûÉ комитет (23) П риоритет

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к методам получения штаммов микроорганизмов, способных продуцировать аминокислоты.

Аминокислоты, получаемые с помощью микроорганизмов, в биологически активной

L-форме, находят широкое применение в качестве кормовых и питательных добавок в сельском хозяйстве и пищевой промышленности, в виде компонентов различных питательных смесей медицинского назначения, используются как реактивы в фармацевтической и химической промышленности.

Микроорганизмы, способные продуцировать аминокислоты в количествах, пригодных для промышленного производства, могут быть найдены в природе, как например, продуценты L-глютаминовой кислоты (1).

Однако подавляющее число других аминокислот (лизин, треонин, изолейцин и др.) способны продуцировать только искусственно полученные мутантные штаммы микроорганизмов, имеющие определенные генетически обусловленные нарушения в регуляции метаболизма и вследствие таких нарушений выделяющие в питательную среду, т, е. продуцирующие, определенные аминокислоты. Указанные генетически обусловленные нарушения (мутации) получают (индуцируют) у микроорганизмов известными способами (2) с помощью различного рода мутагенных факторов (УФ и ионизирующая радиация, химические мутагены). Выделяют мутанты нужного типа также известными методами, либо по определенной питательной потребности муIp танта (ауксотрофности), либо на основе резистентности мутанта к тому или иному структурному аналогу аминокислоты, ингибирующему рост исходного штамма, В частности, известными продуктами L-трео15 нина являются мутаны Е. coli или коринебактерий, резистантные к аналогу треонина

Р-оксинорвалину или мутанты E. coli с несколькими питательными потребностями (3). Аналогорезистентные мутанты Е. coli

2О на углеводах в качестве источника углерода продуцируют около 2- г/л треонина, ауксотрофные мутанты E. coli 6 — 13 г/л, но требуют введения в питательную среду аминокислот в качестве необходимых рос25 TQBbIx факторов.

Известен также метод получения продуцирующих аминокислоты мутантов на основе резистентности одновременно к антиметаболиту (антибиотику или аналогу ами875663

3 нокислоты) и коингибитору (определенной аминокислоте) (4).

Во всех перечисленных случаях мутантные штаммы, способные продуцировать, аминокислоты, получают за счет однократного или последовательного индуцирования мутаций в генетической структуре (геноме) исходного штамма, не выделяющего аминокислоту. До настоящего времени неизвестны штаммы, у которых возрастание продукции аминокислоты достигается за счет увеличения дозы генов, необходимых для ее биосинтеза, или в результате введения в клетку чужеродного генетического материала.

Некоторые практические аспекты применения методов генетической инженерии нашли свое отражение в известном способе получения штаммов Pseudomonas, обеспечивающих деградацию комплекса органических веществ (углеводородов нефти) (5).

В этой работе гибридные молекулы были получены in vivo путем внутриклеточной рекомбинации.

Однако методы получения штаммов продуцентов аминокислот с использованием приемов генетической инженерии до настоящего времени не разработаны. "

В качестве прототипа выбран метод получения штамма Е. coli ВНИИгенетика

14MG — 442, полученного под действием нитрозогуанидина из штамма Е. coli К12 и отобранного по признаку устойчивости к аналогу треонина р-оксинорвалину и способности продуцировать L-треонин (6).

Рассматриваемый в качестве прототипа метод предусматривает мутагенную обработку клеток исходного штамма и отбор нужных мутантов, т. е. способных к продукции аминокислоты, на среде со структурным аналогом аминокислоты, ингибирующим рост немутантных клеток.

Такой метод позволяет получить продуцирующий аминокислоту штамм, не нуждающийся в дополнительных ростовых факторах (например аминокислотах, витаминах и т. д,). Данный признак был определяющим при выборе прототипа.

Однако основным недостатком такого метода остается сравнительно низкая продуктивность полученных штаммов-продуцентов ряда аминокислот, в частности продуцентов L-треонина.

Целью изобретения является увеличение выхода L-треонина.

Для достижения указанной цели получены два штамма — штамм Е. coli ВНИИгенетика Ч1 334рУ № 6 и ВНИИгенетика

VL334pY № 7 — продуценты L-треонина со следующими характеристиками.

Характеристика штамма Е. coli ВНИИгенетика VL334pV № 7.

Штамм Е. coli ВНИИгенетика

1 1334рУ № 7, продуцирующий L-треонин, хранится в Центральном музее промьгш5

65 ленных микроорганизмов йн ститута

«ВНИИгенетика» и имеет регистрационный номер ЦМПМ В-1684, Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами, размером 1,5 — 2 мкм в длину.

Культурально-физиологические признаки.

Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37 С образует колонии диаметром 2—

3 мм, круглые, слегка выпуклые с гладкими краями, структура однородная, прозрачные на свет, консистенция пастообразная, легко эмульгируются.

Агаризованная минимальная среда (Адамса) с глюкозой (0,2О/о) и минеральным азотом, Через двое суток роста при

37 С образует колонии диаметром 1,5—

2 мм серовато-белые, круглые с ровными краями, слегка выпуклые, внутренняя структура однородная.

Рост в мясо-пептонном бульоне — после

24 ч роста при 37 С сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, запах характерный.

Рост в жидкой минимальной среде Адамса — через одни сутки роста при 37 С с аэрацией сильное равномерное помутнение, запах отсутствует.

Рост по уколу в мясо-пептонном arape— хороший по всему уколу.

Желатину не разжижает.

На молоке хороший рост с коагуляцией молока.

Индол образует.

Рост на различных углеводах, хорошо растет на глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе, глицероле и маннитоле с образова:::гем кислоты и газа.

Потребность в факторах роста. Частичная потребность в изолейцине. Время генерации на глюкозо-минеральной среде (Адамса) с изолейцином 60 мин, на среде без изолейцина 270 мин.

Устойчивость к антибиотикам, Устойчив к пенициллину.

Штамм не патогенен.

Содержание плазмиды. В логарифмической стадии роста клетки содержат около

17 копий плазмиды рУ № 7 (мол. вес. 5,7 мегадальтон), обеспечивающей устойчивость штамма к пенициллину и несущей гены треонинового оперона.

Характеристика штамма Е. coli ВНИИгенетика VL334pY № 6.

Штамм Е. соИ ВНИИгенетика

VL334py № 6, продуцирующий 1-теронин, хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов института

«ВНИИгенетика» и имеет регистрационный номер В-1649, Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами, размером 1,5 — 2,0 мкм в длину.

Культурально-физиологические признаки.

Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37 С образует колонии диаметром 2—

3 мм, круглые, слегка выпуклые с гладкими краями, структура однородная, прозрачные на свет, консистенция пастообразная, легко эмульгируются.

Ага ризованная минимальная среда (Адамса) с глюкозой (0,2О/о) и минеральным азотом, Через двое суток роста пои

37 С образует колонии, диаметром 1,5—

2 мм серовато-белые, круглые с ровными краями, слегка выпуклые, внутренняя структура однородная.

Рост в мясо-пептонном бульоне — после

24 ч росте при 37 С сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, запах хар а ктерный.

Рост в жидкой минимальной среде Адамса с необходимыми добавками — через одни сутки роста при 37 С с аэрацией сильное равномерное помутнение, запах отсутствует.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре— хороший по всему уколу.

Желатину не разжижает.

На молоке хороший рост с коагуляцией молока.

Индол образует.

Рост на различных углеводах: хорошо растет на глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, фруктозе, глицероле и маннитоле с образованием кислоты и газа.

Потребность в факторах роста. Частичная потребность в изолейцине, Время генерации на глюкозо-минеральной среде

1 Адамса) с изолейцином 60 мин, на среде без изолейцина 270 мин.

Устойчивость к антибиотикам. Устойчив к пенициллину и тетрациклину.

Штамм не патогенен.

Содержание плазмы. В логарифмической стадии роста клетки содержат около 10 копий плазмиды рУ № 6 (мол. вес 11,2 мегадальтон), обеспечивающей устойчивость штамма к пенициллину и тетрациклину и несущей гены треонинового оперона.

Для достижения поставленной цели в качестве фпагмента ДНК используют ДНК

xpoMocoMû донорного микроопганизма, содержащие гены, контролирующие синтез

L-треонина и имеющие мутацию, нарушающую негативную регуляцию синтеза данной аминокислоты, а в качестве реципиентного штамма используют штамм, имеющий мутацию, частично блокирующую смежный этап метаболизма указанной амннокислотьг.

Кооме - того, объединение фрагмента

ДНК хромосомы донорного штамма Е. со11 осуществляют плазмидой PBR 322, имеющей молекулярный вес 2,8 мегадальтон

in vivo.

875663

Пример 1. Конструирование штамма

Е. coli ВНИИгенетика Ч1 334 рУ № 6.

В качестве донорного штамма используют штамм ВНИИгенетика MG-442. Штамм обладает устойчивостью к аналогу треонина (P-оксинорвалину) и несет мутацию в гене thr А, нарушающую аллостерп еское ингибирование треонином активности гомосериндегидрогеназы — ключевого фермента биосинтеза треонина.

40 В качестве векторной плазмиды используют плазмиду pBR 322 f3). Эта плазмида содержит репликон Со1Е1, имеет мол. вес.

2,8 мегадальтон, детерминирует устойчивость клеток к ампициллину и тетрацикли45 ну. Карта расщепления плазмиды pBR 322 специфическими эндонуклеазами приведена на фиг. 1.

Хромосомную ДНК Е. coli ВНИИгенетика MG-442 и плазмидную ДНК выделяют, как описано ранее (6). Для конструирования гибридных плазмид ДНК из донорного штамма ВНИИгенетика MG-442 и плазмиды pBR 322 обрабатывают эндонуклеазой.

Для этого составляют инкубационную пробу, объемом 100 мкл. которая содержит

60 мМ Na Cl; 10 мМ трисНС1 рН 7,4;

7 мМ MgCI ; 10 мМ 2-меркаптоэтанола;

2 мкг pBR 322; 2 мкг ДНК Е. coli 442;

10 единиц эндонуклеазы Hind I!I. Обработку эндонуклеазной проводят в течение

1 ч при 37 С, затем пробу прогревают

10 мин. при 65 С для инактивации эндонуклеазы. В пробу добавляют 10 мМ дитиотриэтола; 66 мкМ АТФ; 200 г/мл бычье55 го сывороточного альбумина; 0,01 единиц

6

Кроме того, используют фрагмент ДНК хромосомы донорного штамма Е. coli, содержащий гены треонинового оперона, у которого в результате мутации ферментпродукт гена thr А устойчив к ингибированию треонином.

Кроме того, в качестве реципиентного штамма используют штамм Е. coli ВНИИгенетика У1 334, имеющий двойную ауксотрофность по треонину и изолейцину.

Кроме того, трансформацию реципиентного штамма Е. со11 ВНИИгенетика VL 334 проводят гибридной плазмидой рУ № 6, имеющей молекулярный вес 11,2 мегадальтон, состоящей из двух молекул плазмиды рВ R 322 с молекулярным весом 5,6 мегадальтон и содержащей функционирующие гены треонинового оперона фрагмента ДНК хромосомы донорного штамма Е. coli.

Кроме того, трансформацию реципиентного штамма E. со!1 ВНИИгенетика

У1 334 проводят гибридной плазмидой рУ № 7, имеющей молекулярный вес 5,7 мегадальтон, состоящей из пл аз миды рВ R 322 с молекулярным весом 2,8 мегадальтон и содержащей функционирующие гены треонинового оперона фрагмента

ДНК хромосомы донорного штамма Е. coli, 875663

5 0

Зо

65 полинуклеотидлигазы и ипкубируют в течен ие 24 ч при 6 С.

Полинуклеотидлигазу выделяют по методу Ричардсона. Полученную смесь гибридных молекул используют лля трансформации Е. coli С600 (leu thr). Трансформанты высева. от на чашки с минимальной средой Адамса, содержащей ампициллин в концентрации 200 мкг/мл. После инкубации в течение 48 ч при 37 С с этих чашек отбирают клоны трансформантов, устойчивые к ампициллину и способные расти без треонина. Из одного произвольно выбванного клона выделяют плазмидную

ДНК.

Выделенную гибридную плазмидную

ДНК, в дальнейшем именуемую рУ № 6, исследуют с помощью электронно-микроскопических и электрофоретических методов. На основании этих результатов строится карта расщепления плазмиды рУ № 6 специфическими эндонуклеазами (см. фиг. 2).

Гибридная плазмида рУ № 6 имеет молекулярный вес 11,2 мегадальтон и состоит из двух молекул плазмиды pBR 322 (мол. вес 5,6 мегалальтон) и фрагмента хромосомы (мол. вес 5,6 мегадальтон) донорного мутантного штамма MG-442, содержащего все три функционирующих гена треонинового оперона, у которого в результате мутации пподукт геня

thr А устойчив к ингибированию треонином, и также содержащего балластный генетический материал.

Две молекулы плазмилы пВК 322 в составе гибридной плазмиды рУ ¹ 6 осуществляют автономную оепликацию плазмиды рУ № 6 в клетке и обеспечивают устойчивость клеток к пенициллину и тетрациклину.

В логарифмической стадии роста клетки могут содержать 10 копий гибридной плазмиды.

Карта расщепления гибридной плазмичы рУ № 6 специфическими эндонуклеазами приведена на фиг. 2.

Для того, чтобы определить, какие гены треонинового оперона солеожатся и функционируют на плазмиде рУ № 6, эту плазмиду использ ют для трансформации в штаммы E. coli с мутациями по пазличным генам треонинового опепона: G TI4 (thr А)

VL 361 (thr В) и VL 334 (Йг С) . В двух последних штаммах мутации Йг В и thr С из штаммов G Т25 и G Т28, соответственно, были объединены с мутацией ilv с помощью трандукции.

Трансформанты высевают на минимальную среду, содержащую ампициллин. Все устойчивые к ампициллину трансформанты штаммов GT14, VL 361 и VL 334 способны расти на среде без треонина. Результаты позволяют заключить, что плазмида рУ№6

8 содержит все три функционирующих гена треонинового оперона: thr А, thr В, thr С.

Для получения штамма-продуцента треони Iai плазмида рУ № 6 используется для трансформации в реципиентный штамм VL 334, несущий мутации в генах

thr С и thr A.

Хавактеристика пеципиентного штамма

В НИИгенети ка И 334.

Штамм ВНИИгенетика И 334 является производным штамма ВНИИгенетика

MG-442, получен трансдукцией фагом Pl в этот штамм мутации thr С из штамма

G Т28.

Морфология. Грамотрицательные слабо подвижные тонкие палочки с закругленными концами, размером 1,5 — 2,0 мм в длину.

Культурально-физиологические признаки.

Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37 С обра зует колонии диаметром 2—

3 мм, круглые, слегка выпуклые с гладкими краями, структура однородная, прозрачные на свет, консистенция пастообразная, легко эмульгируется.

Агаризованная и минимальная среда (Адамса) с глюкозой (0,2О/о) и минеральным азотом. Через двое суток роста при

37 С образует колонии диаметром 1,5—

2.0 мм серовато-белые, круглые с ровными краями, слегка выпуклые, внутренняя структура однородная.

Рост в мясо-пептонном бульоне. После

24 ч роста при 37 С сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, запах хар а ктерный.

Рост в жидко и минимально|й сведе

Лламса с необходимыми добавками. Через одн|и сутки роста при 37 С с аэрацией сильное равномерное помутнение, запах отсутствует.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре хопоший по всему уколу.

Желатину не разжижает.

На молоке хоро щей рост с коагуляцией молока..

Индол образует.

Рост на различных углево|дах: хорошо растет а глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе, глицироле и маннитоле с образованием кислоты и газа.

Потребность в факторах роста. Нуждается лля роста в треонине и изолейцине (20 мкг/мл). Потребность в треонине связана с мутацией thr С 1010, нарушающей синтез треонина, а потребность в изолейцине — с мутацией ilv А 442, блокирующей первую реакцию на пути превращения треонина, в изолейцин. Фермент треониндезаминаза, поврежденный мутацией

ilvA442, сохраняет остаточную активность (менее 1 /о от исходного уровня). Поэтому при повышении внутриклеточной концентрации твеонина IIDQHcõoäèò частичная

875663

9 компенсация мутации ilv А 442, т. е. кл етки приобретают способность к росту в отсутствие изолейцина в среде.

Мутация йг С необходима для отбора трансформаторов, получивших гибридную плазмиду. Зти трансформаторы должны быть устойчивы к ампициллину и расти на среде без треонина. Мутация активирует выражение треокинового оперона, так как блокирует синтез изолейцина, участвующего в репрессии треонинового оперона,. Кроме того, она частично блокирует превращение треонина в предшественник изолейцина-а-кетомасляную кислоту. Реципиент является ауксотпофом по треонину и изолейцину, однако расчет íà спеде без изолейцина при высокой концентрации треонина.

Трансформ анты, получившие плазмид) пУ № 6, отбирают на среде, содепжащей

200 мкг/мл: ампициллина, но без тпеонина.

Клетки одного произвольно выбранного клона трансформантов выращивают на бульоне Хоттингера с ампициллином и из них выделяют плазмидну".о ДНК и спавнивают ее физико-химические параметпы (мол. вес, паспречеление y,àñòêoâ пасшепления опецифическими эндончклеазами) с параметпами плазмиды рУ № 6, установленными ранее (см, фиг. 2). Совпадение указанных свойств свидетельствует о том, что клетки выбпанного клона содепжат плазмичу пУ № 6, и плазмида стабильно существует в них в указан ных условиях культивипования. Пол чечный штамм в; а.чьнейшем именуют ВНИИген,етика у 1 334 пУ № 6.

Полученный штамм устойчив к ампициллину и тетрациклину и способен расти на среде без треонина и нзолейцина. Способность расти без изолейцина связана с вы,— соким уровнем синтеза тпеонина в этих клетках. Генотип реципиентного штамма (мутация ilv А) обусловливает, тем самым, селективное преим щество клеткам, содержащим плазмиду рУ № 6.

П р и м е и 2. Конструирование штамма

Е. coli ВНИИгенетика-Ч1 334 рУ № 7.

Фрагмент ДНК Е. coli в составе п.чазмиды ру М 6 больше размера треониновсго опепона. Удаление балластного генетического материала. может увеличить жизнеспособность бактерий я оказать положительное действие на стабильность плазмиды. В связи с этим плазмиду рУ № 6 обрабатывают специфическими эндонуклеазами Hind III u Ram Hi. Инкубацион ная проба, объемо м 100 мкл, имеет тотже состав, что и в примере 1, но кроме того, содержит 6 единиц эндонуклеазы Bam Hi.

После инактивации ферментов прогреванием при 65 С в течение 10 мин смесь обрабатывают полинуклеотидлигазой (п ример 1), 10

5

25 зо

Полученная смесь гибридных молекул используется для трансформации штамма

Е. col i С600. Отбор клонов и выделение плазмидной ДНК производят как в примере 1. Выделенная гибридная плазмида, в лалы ейшем имен емая рУ № 7, имеет мат. пес:,4 ме"ада.чьтон. Капта пасщеп. ения этой плазмнды специфическими энл нуклеазами ппиведена на рис. 3. ТрансФормация рУ № 7 в иутантные штаммы

Е. coli показывает, что эта плазмида имеет все тпи гена треонинового оперона: йгА,йгВийгС.

Характеристика плазмиды рУ № 7.

Гибридная плазмила рУ № 7 имеет молекуляпный вес 5,7 мегадальтон и состоит из плазмичы пВ R 322 (молекулярный вес

2,8 мегадальтон) и фпагмента хромосомы (молеку,чарный вес 2,9 мегадальтон) мутантного донопного штамма MG 442, содержащего все три функционирующих гена треонинового оперона., у которого в результате мутации продукт гена thr А устойчив к ингнбированию треонином.

Плазмида пВ R 322 в составе гибридной плазмилы пУ № 7 ппедставлена фрагментом ДНК, способным осуществлять автономную репликацию гибридной плазмиды и обеспечивать устойчивость клеток к пенициллину.

В логарифмической стадии роста клетки могут содержать 17 копий гибридной плазм и,чы.

Капта пасщепления гибридной плазмиды р У М 7 специфическими эндонуклеазами приведена на фиг. 3.

После трансфопмании рУ № 7 в реципиентный штамм Ч1 334 (пример 1) отбипают клок, в,чальнейшем именуемый

ВНИИгенетика у 1 334 рУ 7, устойчивый к ампициллину и способный расти на среде без изолейцина и треонина.

Пример 3. Получение L-треонина с помощью Е. coli, несущих гибридные плазми,ч ы.

Штаммы, полученные по способу, описанному в примерах 1,2 и пепечисленные в таблице, засевают петлей с косяка агапизовакной среды Адамса,, содержащей

0,5 мг/мл калиевой соли берзилпенициллина, в конические колбы, емкостью

250 мл, содержащие по 30 мл жидкой среды Адамса (глюкоза 1 о/о, тиамин: 100 мкг/л).

После посева кол бы устанавливают на круговую качалку (200 об/мин) и инкубируют в течение 18 ч при 37 С. Выращенный таким способом посевной материал используют в количестве 1 мл для засева предварительно простепилизованной ниже описанным мето;чем ферментационной среды, разлитой по 15 мл в кснические колбы, емкостью 250 мл.

Ферментационные среды имеют следующий состав, г/л .

875663

11

Среда 1 Среда 2

Глюкоза 30 50 (NH )-S0 10 15

КН Р04 2 2

М ВО, 1 1

СаСОз 20 20

Тиа мин 0,0001 0,0001

Среда 3

5

0,0001

Плазмиды в клетках штамма, p,"î

Накопление треонина, Г/л

Ферментационная среда, л(Штамм

MG-442

Нет плазм иды

3,0

3,3 55 рУ N6

VL 334 pYN6

7,0

1 1,2

14,4

200 60

13,3

16,5 рУ N7

VL 334 рУМ7

L-треонин выделяют из культуральной жидкости известными методами. 65

Фепментационные спелы стерилизуют в янтоклаве при избыточном давле. ии 10

0,5 амт в течение 15 мин. Мел стерилизуют стдельно и вносят B среду после степи,чизации. После добавления мела среда имеет пН 6,8 — 7,2.

Колбы, содепжящие чказанные соечы, 15 и сле посева кччьтчпамч чказанчых в таблипе штаммв чстянавчивают на кпчговчю ка а.ткч (Р/50 об мин) и инкчбипчют 48 ч ппи 37 С. 95% клеток после Аепментапии сохпачяют сгособность пастч без треонина 20 и изолейцина и устойчивы к ампициллину, что свилетельствчет о наличии плазмид в клетках данных штаммов.

Количество тпеонина, обоазованного штяммами. показано B таблице. 25

Пои получении L-тпеонина в фепмеитепе посевной матепиал штаммаЧ1 334 пУ ¹ 6, полчченный, как описано в ппимепе 3, в коли естве 25 мл вносят в лабооатопный фепментео мапки Biflo С230, куча 30 ппедвапительно помещают 250 мл ферментапионной спеды.

1. Режим ферментации следующий: температура 37 С, ко.чичество поступающего в аппарат воздуха 1.1 (по потаметрч), ско- 35 пость мешалки 900 об/мин. Чепез 28 ч. после начала феоментации ппистчпают к полаче подпитки, поедставляющей собой лесятикпатный концентрат феоментациснной спеды 1, из состава которой исключен 40 мел . Подпитку производят с помощью пепистальтического насоса со скооостью

1,5 мл/ч. Чепез 51 ч после начала ферментации в: спеле накаплива,ется тпеонин в количестве 20 г/л 95/о клеток пос.ле фермен- 45 тации содепжат пла змиду рУ № 6.

12

Как видно из данных таблицы наиболее высокий vBoвень обпазования аминокислоты имеет место v штаммом, солепжащих пибпичн ю плазмилч. Использование этого метопа позволяет почччить штаммы E. cn1i

ВНИИ"енетикя VI. 334 ич № 6 и ВНИИгенетика Ч1 334 рУ № 7, способные накапливать до 20 г/л тпеонина ппи культивиповании на минера.льной среде с глюкозой, тиамином. Полученные штаммы обладают высокими технологическими показателями — они превосходят по продчкти вности все известные в мипе штаммы и не тпебчют сложенных или дооогих питательных печ.

Формула изобретения

-1. Штаммы Е. coli ВНИИгенетикаЧ1 334 пУ № 6 и ВНИИгенетика И 334п У № 7 продуценты L-тпеонина хоанятся в центральном мчзее поомышленных микроортанизмов инститчта «ВНИИгенетика» и имеют пегистрационные номера В-1649 и

В-1684.

Мопфология. Гпамотоицательные слабополвижные тонкие, палочки с закоугленными концами, размером 1,5 — 2,0 мм в длину.

Культурально-физиологические призна; ки.

Мясо-пептонный агар. Через 24 ч роста чри 37 С образует колонии диаметром 2—

3 мм, круглые, слегка выпуклые с гла дкими краями, структура однородная, поозрачные на совет, консистенция пастообразная, легко эмчльгируются.

Ага пизованная и минимальная среда (Адамса) с глюкозой (0,2%) и минеральным азотом. Чепез двое суток роста при

37 С обпазует колонии диаметром 1,5—

2 мм, серовато-белые, кпчглые с ровными кп аями, слегка выпуклые, внутренняя стпчктур а однородная.

Рост в мясо-пептон ном бульоне — после

24 ч роста при 37 С сильное равномерное помутнение, небольшой осадок, запах характеоный.

Рост в жидкой минимальной среде Адамса с необходимыми добавками — через одни сутки роста при 37 С с аэрацией сильное павномерное помутнение, запах отсчтств5 ет.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре— хопоший по всему уколу.

Желатину Нр. разжижает.

На молоке хороший рост с коагуляцией молока.

Индол образует.

Рост на различных углеводах: хорошо

ВасТеТ на глюкозе, лактозе, ман нозе, галактозе, ксилозе, фоуктозе, глицеполе и мачнитоле с образованием кислоты H газа.

Потребность в факторах роста. Частичная потребность в изолейцине. Время ге878663

14 нерации на глюкозо-минеральной среде

Адамса с изолейцином 60 мин, на среде без изолейцина 270 мин.

Устойчивость к антибиотикам. Устойчив к пенициллину и тетрациклин у.

Штамм не патогенен.

Содержание плазмиды. Для штамма, Е. coli ВНИИгенетика У1 334 рУ №. 6 в логарифмической стадии роста клетки содержат около 10 копий плазмиды рУ № 6 (мол. вес. 11,2 мегадальтон), обеспечивающей устойчивость штамма к пенициллину и тетрациклину и несущей гены треони нового оперона. Для штамма Е. coli

ВНИИгенетика Ч1 334 рУ № 7 в логарифмической стадии роста клетки содержат около 17 копий плазмиды рУ № 7 (мол. вес 5,7 мегадальтон), обеспечивающей устойчивость штамма к пенициллину и несущей гены треонинового оперона.

2. Способ получения штаммов Е. coli продуцентов L-треонина по п. 1, включающий объединение фрагмента ДНК хромосомы донорного микроорганизма с векторной молекулой ДНК, предпочтительно с плазмидой, и трансформацию полученной гибридной молекулой ДНК реципиентного микроорганизма., отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода

L-треонина, в качестве фрагмента ДНК используют ДНК хромосомы донорного микроорганизма, содержащие гены, контролирующие синтез L-треонина и имеющие мутацию, нарушающую негативную регуляцию синтеза данной аминокислоты, а в качестве реципиентного штамма используют штамм, имеющий мутацию, частично блокирующую смежный этап метаболизма указанной аминокислоты.

3. Способ по п. 2, отлич ающийся тем, что объединение фрагмента ДНКхромосомы донорного штамма Е. СО11 осуществляют с плазмидой рВК 322, имеющей молекулярный вес 2,8 мегадальтон.

4. Способ по п. 2, отлич ающий ся тем, что используют фрагмент ДНК хромосомы донорното штамма Е. coli, содержащий гены треонинового оперона, у которого в результате мутации ферментпродукт гена thr А, устойчив к ингибированию треонином.

5. Способ по пп. 1 — 4, отлич ающи йс я тем, что в качестве реципиентного

5 штамма используют штамм Е. coli

ВНИИгенетика VL 334, имеющий двойную ауксотрофность по треонину и изолейцину.

6. Способ по пп. 1 — 5, отлич а ющийс тем, что трансформацию реципиентного

10 штамма Е. coli ВНИИгенетика VL 334 проводят гибридной плазмидой рУ № 6, имеющей молекулярный вес 11,2 мегадальтон, состоящей из двух молекул плазмиды

pBR 322 с молекулярным весом 5,6 мега15 дальтон и содержащей функционирующие гены треонинового оперона фрагмента

ДНК хромосомы донорного штамма E. coli.

7. Способ по пп, 1 — 5, отл и.ч ающий20 ся тем, что трансформацию реципиентного штамма E. coli ВНИИгенетика VL 334 проводят гибридной плазмидой рУ № 7, имеющей молекулярный вес 5,7 мегадальтон, состоящей из плазмиды pBR 322 с

25 молекулярным весом 2,8 мегадальтон и содержащий функционирующие гены треонинового оперона фрагмента ДНК хромосомы донорного штамма Е. coli.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США 3002889, кл. 195 — 28,30, 1969.

2. Патент Великобритании 1258380, кл. С

35 6F, 1969.

3. Патент Франции 1579835, С 12D, 3/06, 1972.

4. Патент США 3756916, кл. 195 — 78.96, 1974.

40 5. Патент США 3923603, кл. 195 — 103,5, 1975.

6. Гусятинер М. М., Жданова Н. И. и Лившиц В. А. Исследование фракции гена геl

А в выражении аминокислотных оперонов.

45 Сообщение П. Влияние аминного состояния гена геl А на сверхсинтез треонина мутантов Е. coli К-12, устойчивых к р-оксинорвалину. ж. Генетика, 14, № 6, 1978, с. 957.

875663

Hind u

- сол1

Hind Я

Вот ю/

5а1Р7

Етая

Фиг. 1

Нспб и

Hind Ill

Яа1&Х

Есо Т

8am i фиа Я

Корректор Л. Орлова

Редактор П. Горькова

Заказ 1441/15 Изд. № 217 Тираж 570 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений п открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Составитель А. Макаров

Техред А. Камышникова

ind (7

nm u.