Способ выделения мутантов дрожжей,поглощающих из среды и включающих в днк экзогенные нуклеотиды

Способ выделения мутантов дрожжей,поглощающих из среды и включающих в днк экзогенные нуклеотиды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е " 878794

ИЗОБР ЕТЕ Н И Я

К, АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 05.07.79 (21) 2791445/28-13 с присоединением заявки X: —(23) Приоритет— (51) М Кч

С 12 N 15/00

Государственный комитет по делам изобретений (43) Опубликовано 07.11.81. Бюллетень Ме 41 (53) УДК 576.8 (088.8) и открытий (45) Дага опубликования описания 07.11.81 (72) Авторы изобретения л

I

1 а

1 й

В. Г. Королев, Л. М. Грачева, Е. Л. Ивано и В. П. Ткаченко

Ленинградский институт ядерной физики I,.

Б П К (71) Заявитель

ДРОЖЖЕЙ, ПОГЛОЩАЮЩИХ ИЗ СРЕДЫ

И ВКЛЮЧАЮЩИХ В ДНК ЭКЗОГЕННЫЕ

НУКЛ EOT ИДЫ

Предлагаемое изобретение относится к области биохимии и генетики микроорганизмов, в частности к получению штаммов дрожжей, поглощающих экзогенные нуклеотиды, которые могут быть использованы в молекулярной биологии и генетике для введения специфической метки в виде любых азотистых оснований ДНК.

Известны способы выделения мутантов дрожжей, поглощающих из среды и включающих в ДНК экзогенные нуклеотиды

Согласно известному способу радиоактивный тимидинмонофосфат (ТМФ) включают в ДНК дрожжей путем отбора из имеющейся коллекции штаммов, которые способны усваивать ТМФ из среды роста (1).

Известен способ выделения мутантов дрожжей путем специфического мечения

ДНК клеток дрожжей дезоксиаденозином (2).

К недостаткам известных способов относится то, что невозможно получить высокую удельную активность изотопа в тимидиновом звене ДНК (низкая эффективность способа) и большой расход радиоактивного предшественника (ТМФ) .

Отсутствует универсальность в отношении различных предшественников синтеза

ЦНК, т. е. невозможность включать из питательной среды в ДНК все азотистые основания, составляющие структуру последней. Существенным недостатком второго способа является предпочтительное включение метки в митохондриальную, но не в

5 ядерную ДНК, что предопределяет использование данного метода для специфического мечения митохондриальной Д1П(.

Ближайшим к изобретению техническим решением по технической сущности и до10 стигаемому эффекту является способ выделения мутантов дрожжей, поглощающих из среды и включающих в ДНК экзогенные нуклеотиды, предусматривающий использование селектирующего фактора, обработ15 ку мутагеном, высев микроорганизмов на питательную среду, содержащую источник углерода, минеральные соли с добавлением нуклеотида, необходимого для отбора мутантов, способных поглощать этот нук2О леотид, выращивание известным способом с последующим отбором мутантов с целевыми свойствами (3)

По известному. способу в УЕР среду вносятся ингибиторы тимидилат синтета25 зы — аминоптерин (50 мкг/мл), сульфани. ламид (6 мкг/мл), а также тимидинмонофосфат (100 мкг/мл). На эту среду высе вается двухдневная культура клеток дрожжей в концентрации примерно 10 клеток/ зо чашку. Чашки инкубируют при 30 С в те878794

3 чение 3 — 4 дней. Мутанты, способные поглощадь ТМФ, возникают спонтанно с частотой 2 10 " и no@, действием этилметансульфоната 4 10- . Селекция мутантов проводится при рН 4--б. Указанный способ позволяет получать мутанты дрожжей, усваивающие из среды ТМФ. Методом ступенчатого отбора получают мутанты, способные расти в присутствии ингибиторов синтеза ТМФ на концентрациях ТМФ от

100 мг/мл до 10 мг/7. !-1аиболее эффективные мутанты применяются для мечеиия

ДНК дрожжей тимидинмонофосфатом (ТМФ) и его аналогами (йоддезоксиури динмонофосфат, бромдезоксиуридинмонофосфат), в состав которых входят все возможные радиоактивные изотопы (Н-ТМФ, = С-ТМФ - Р " Р-ТМФ. "1-УМФ). Пр этом достигаются высокие удельные активности изотопов в ДНК.

Известный способ получения ТМФ-усваивающих мутантов не дает возможности включать в ДНК весь спектр нуклеотидов, так как используемые ингибиторы тимиди

;атсинтетазы ис позволяют пошить задачу включения в ДНК дрожжей любых нуклеотидов, как пиримидинов, так и пуринов.

Кроме того, этот способ требует использования дорогостоящего и невыпускаемого отечественной промышленностью пнгибитора (аминоптерина).

Цель изобретения — выделение мутантов с расширенным спектром поглоще ния нуклеотидов и упрошение способа.

Поставленная цель достигается тем, что в способе выделения мутантов дрожжей, поглощающих из среды и включающих в

ДНК экзогенные нуклеотиды, путем исследования селектируюшего фактора, обработки мутагеном, высева микроорганизмов на питательную среду, содержащую источник углерода, минеральные соли с добавлением нуклеотида, необходимого для от бора мутантов, способных поглощать этот нуклсотид, выращивания известным способом с последующим отбором мутантов с целевыми свойствами, предусмотрено использование в качестье селектирующего фактора мутаций ауксотрофности 110 урацилу и аденину, концентрацию микроорганизмов берут 106 — -10" клеток на чашку

Петри, при этом из нуклеотидов добавле ние уридинмонофосфата (УМФ) или аденозинмонофосфата (АМФ) в концентрации 1 — 2 мМ, и проведение отбора мутантов по величине выросших колоний мутантов с последу|ощим культивирова гпсм их в жидкой питательной среде, сод".-ржа щей 0,25 — 2,0 мМ УМФ или АМФ.

Сущность предлагаемого способа заклю: ается в том, что биосинтез УМФ или

АМФ блокируется мутациями ауксотрофности по урацилу или аденипу. При этом на минимальной среде сУМФ или АМФ могут расти только мутанты, способные усва4 ивать этн нуклеотиды пз среды роста. Для получения мутантов на минимальную среду с добавкой уридинмонофосфата (1 мМ) наносят культуру дрожжей генотипа а usa. <

5 с концентрацией 10 клеток/чашку. Затем чашки облучают УФ-лучами при выживаемости клеток 10 /о и инкубируют при 30" С в течение 7 — 10 дней. Далее отбирают 50 наиболее крупных колоний для дальнейше-!

О го анализа. Анализ проводят по следующей схеме. В стерильные пробирки вносят 2 мл жидкой минимальной среды с различными концентрациями УМФ (О, 0,25; 0,5; 0,75;

1,0; 1,5; 2,0) мМ. B пробирку вносят сус15 пензию отобранных мутантов (10 4 кл/мл), инкубируют при 30 С в течение 3 дней. По степени помутнения среды судят о способ ности роста полученных мутантов иа среде с различными концентрациями УМФ. За20 тем отбирают мутанты, способныс активно расти на среде с 0,25 мМ УФМ. Эти мутанты используют для роста исключительно экзогенные пиримидиновые предшественники нуклеиновых кислот. После этого

25 клетки наиболее эффективного мутанта вы ращивают на среде с радиоактивным предшественником ДНК. Для этого двухсуточную культуру клеток вносят в минимальную жидкую среду с концентрацией УМФ

З0 либо 0,25, либо 1,0 мМ. При малых концентрациях УМФ (0,25 мМ) количество клеток на 1 мл составляет 10, при боль ших концентрациях (1,0 мМ) — 10 . Обе используемые концентрации УМФ обеспечиз5 вают лишь минимальные потребности клетки в пиримидиновых предшественниках нуклеиновых кислот. Известно, что количе ство УМФ, используемое клеткой дрожжей для синтеза РНК, примерно в 50 раз боль40 ше, чем для синтеза ДНК. А дезоксинуклеотиды в основном включаются в ДНК.

Поэтому соотношение меченых и немеченых пиримидинов в ДНК значительно выше, чем в среде роста. Так как недостаю

45 щее количество пиримидиновых предшественников ДНК восполняется в результате биохимических реакций из УМФ, то для роста клеток не требуется добавки нерадиоактивных пиримидиновых предшественБО ников ДНК. Радиоактивный предшествен ник ДНК с максимальной удельной активностью добавляется в среду роста в конечной концентрации 10 — 100 мкКи/мл.

После 40 ч выращивания клетки отделяют

55 от радиоактивной среды, промывают фос<ратным буфером (рН = 7) и ресуспендируют в этом же буфере.

Полученные радиоактивные клетки про веряют по трем параметрам. Во-первых, 60 определяется количество метки, поглощенной клетками. Определенное количество клеток гидролизуется. Радиоактивност гидролизата определяется на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Во-вторых, оп

55 ределяется соотношение трития в ДНК и

878794

РНК по методу Хатсфельда. Результаты определений показывают, что более 30 /о дезоксицитин- и более 60 /о тимидинмонофосфата обнаруживается в ДНК клетки.

В-третьих, методом седиментации в градиенте С Cl определяют соотношение метки в ядерной и митохондриальной ДНК. Результаты определений показывают, что подавляющее количество метки обнаруживается в ядерной ДНК. Подобным же спосо бом, используя ауксотроф по аценину генотипа à adex, получают мутангы, поглощающие пуриновые предшественники ДНК.

Таким образом, предлагаемый способ в результате использования мутации ауксо трофности по урацилу и аценину, позволяет получать мутанты дрожжей, способные эффективно и специфически поглощать экзогенные дезоксинуклеотиды в ядерную

ДНК.

П р и мер 1. Двухсуточную культуру ауксотрофного по урацилу мутанта высевают на минимальную среду с 1 мМ УМФ.

Концентрация клеток составляет 10 на чашку. 10 чашек с культурой облучают до зой УФ-лучей, вызывающей 90О/о-ную гибель клеток. После 7 дней инкубирования таких чашек в термостате при 30 С на каждой чашке появляется множество колоний мутантов дрожжей, способных усваивать экзогенный УМФ. Отбирают наиболее крупные колонии, клетки которых наиболее эффективно усваивают экзогенный УМФ, и поэтому обладают повышенной по сравнению с другими мутантами скоростью роста. Затем двухсуточную культуру отобранных мутантов вносят в минималнную жидкую среду, объемом 3 мл, с

0,25 мМ УМФ в конечной концентрации клеток, равной 10 на мл. Затем к суспензии добавляют 0,1 мКи/мл метил-ЗН-тимидинмонофосфат (7 Ки/мМ) (выпускаемый

Л е пи нградским отделением ВО «Изотоп») .

После 40 ч выращивания клетки отделяют от радиоактивной среды, четырежды промывают фосфатным буфером, ресуспендиру ют в 3 мл минимальной среды без глюкозы.

К 0,1 мл суспензии радиоактивных клеток прибавляют 0,2 мл 10О/о-ной трпхлоруксусной кислоты, производят гидролиз

ДНК при 30 С в течение 2 суток. После этого 0,1 мл гидролизата вносят в кювету с жидким сцинтиллятором и определяют число импульсов в мин на счетчике Nuclear Chicago. Обычно при эффективности счета 40 число импульсов на пробу со. ставляет (2 — 5) 10 .

Пример 2. Двухсуточную культуру ауксотрофного по аденину мутанта высева ют на минимальную среду с 1,5 мМ АМФ.

Концентрация клеток составляет 10 на чашку. 10 чашек с культурой облучают дозой УФ-лучей, вызывающей 90О/о -ную гибель клеток. После 7 дней инкубирова

З0 зэ

55 б0

6 ния таких чашек в термостате при 30 С на каждой чашке появляется множество колоний мутантов дрожжей, способных усваивать из среды экзогенный АМФ. Отбирают наиболее крупные колонии. Затем двухсуточную культуру отобранных мутан тов вносят в 3 мл минимальной жидкой среды с 1 мМ аденозинмонофосфата так, чтобы конечная концентрация клеток достигла 10 на мл. Затем к суспензии добавляли 10 — 20 мк/Ки 8- Н-дезоксиаденозинмонофосфата с удельной активностью

10 — 14 Ки/мМ. (Препарат поставляется

Ленинградским отделением ВО «Изотоп»).

После 40 ч выращивания клетки отделяли от радиоактивной среды, четырежды промывали фосфатным буфером (pH=70) и ресуспендировали в 3 мл минимальной среды без глюкозы; 0,1 мл полученной суспен зии (10 клеток) смешивали с 0,2 мл 10 /оной трихлоруксусной кислоты н гидролизовали ДНК при 30 С. в течение 2 суток.

Затем 0,1 мл гидролизата вносили в фла коны с жидким сцинтиллятором и определяли число импульсов в мин.

При эффективности счета 40О/о пробы обычно считают (2 — 5) 10" имп/мин.

Пример 3. Двухсуточную культуру аксотрофного по урацилу мутанта высевали на минимальную среду с 2,0 мМ УМФ.

Концентрация клеток составляет 10 на чашку. После 7 дней инкубировачия таких чашек в термостате при 30 С на каждой чашке появляются колонии спонтанно воз никших мутантов дрожжей, способных усваивать экзогенный УМФ. Отбирают наиболее крупные колонии. Затем двухсуточную культуру отобранных мутантов вносили в 3 мл минимальной жидкой среды с

1 мМ УМФ так, чтобы конечная концентрация клеток достигала 10 на мл. Затем к суспензии добавляли 10 — 20 мк/Ки 5-"Ндезоксицитидинмонофосфата с удельной активностью 15 Ки/мМ. (Препарат 5- HдЦМФ поставляет Ленинградское отделение ВО «Изотоп»). После двух дней выращивания клетки отделяли от радиоактивной среды, четырежды промывали фосфатным буфером и ресуспендировали в 3 мл минимальной среды без глюкозы. 0,1 мл полученной суспензии {10 кл) смешивали с 0,2 мл 10 /о-ной трихлоруксусной кислоты и гидролизовали ДНК при 30 С в течение 2 суток. Затем 0,1 мл гидролизата вносили во флакон с жидким сцинтиллятором и определяли число импульсов в мин на жидкостном сцинтилляционном счетчике. При эффективности счета около

40 /о пробы обычно считали (2 — 4) °

103 имп/мин.

Предлагаемьш способ позволяет полу чать мутанты дрожжей, спосэбные эффективно и специфично включать из среды роста в ядерную ДНК все четыре дезокси нуклеотида, и не требует дорогостоящих и

878794

Составитель В. Голимбет

Текред И. Пенико 1(орректоры О. Гусева и Т. Трушкина

Редактор И. Марголис

Подписное

Заказ 7396

Изд. М 572 Тираж 530

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская наб., д. 4/5

Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполиома редких ингибиторов, не выпускаемых отечественной промышленностью.

Формула изобретения

Способ выделения мутантов дрожжей, поглощающих из среды и включающих в

ДНК экзогенные нуклеотиды, предусматривающий использование селектирующего фактора, обработку мутагепом, высев мик роорганизмов на питательную среду, содер жащую источник углерода, минеральные соли с добавлением нуклеотида, необходимого для отбора мутантов, способных пог лощать этот нуклеотид, выращивание известным способом с последующим отбором мутантов с целевыми свойствами, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью выделения мутантов с расширенным спектром погло щения нуклеотидов и упро цения способа, в качестве селектирующего фактора используют мутации ауксотрофности по аденину и урацплу, концентрацию микроорганизмов берут 10в — -10 клеток на чашку Пстри, при

8 этом из нуклеотидов добавляют уридинмонофосфат (УМФ) или аденозинмонофосфат (АМФ) в концентрации 1 — -2 мМ, а отбор мутантов проводят по величине выросших

5 колоний мутантов с последующим культивированием их в жпдкой питательной среде, содержащей 0,25 — 2,0 мМ УМФ или АМФ.

10 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. М. Brendel, К, Н, Haynes «Exogenic

timidine-S -топо phosphate as precuser for

DNA synthesis in yeasto». Моlес. gen. Ge15 пе1Й, У. 126, 337, 1973.

2, Глазер В. М., Лучник А. И, и Шевченко С. В. Специфичность включения радиоактивного дезоксиаденазина в митохондреальную ДНК у дрожжей Saccharomyces

20 cerevisiue. ДАН СССР, т. 241, 215, 1978.

3. 1 . В, Wiener «Mutanto о1 Saccharo

myces cerevisiae, which incorporate dioxytiппйпе S -nionophospate into ЬХА in vivo», 1, Вас ег101, у. 117, ¹ 1, 252, 1974.