Способ определения гонадотропной активности гипофизов рыб

Способ определения гонадотропной активности гипофизов рыб

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ ИТИЛЬСТВУ (б1) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 31,03,80 (2Ì) 2904017/28-13 (51)M. КЛ.

А 01 К 61/00 с присоединением заявки йо(23) Приоритет—

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий

Опубликовано 2311,81. Ьюллетень ) (9 43 (53) УДК 639 ° 3.

04 (088е8) Дата опубликования описания 2 1U31 (72) Автор изобретений

A,Á. Бурлаков (7! ) Заявитель

Московский ордена Ленина и ордена Тр

Знамени государственный университет им.И.В. осова (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОНАДОТРОННОЙ АКТИВНОСТИ

ГИПОФИЗОВ РЫБ

Иэобретейие относится к рыборазведению,в частности к способам определения гонадотропной активности гипофизов рыб.

Известен способ определения гонадотропной активности гипофизов рыб, заключающийся в обработке культуры тканей ооцитов рыб в питательной среде стандартным и определяеьым растворами гормонов с последующей инкубацией при температуре 18-20оС и определением количества созревших. ооцитов (1).

Недостатки известного способа заключаются в небольшой точности ,из-за разной индивидуальной и .се зонной чувствительности самок вьюна

:к гонадотропным гормонам, необходи.мости использования большого числа 2О рыб и проведения при каждом тестировании сравнения с действием стандартного препарата, действенности способа только при условии высокой чувствительности самок к гонадотро- 25 пинам (необходимость созревания более 50% животных при введении гормона).

Цель изобретения - повышение точности, Цель достигается тем, что согласно способу, заключающемуся в обработке культуры тканей ооцитов рыб в пительной среде стандартным и определяеваам растворами гормонов с последующей инкубацией при темпера- туре 18-20оC и определением коли» честна созревших ооцитов, обработке подвергают культуру тканей ооцитов самок рцб с низкой чувствительностью к гонадотропным гормонам, инкубацию проводят до появления 2-3% созревших ооцитов, гонадотропную актив- ность гормонов рыб определяют по

Формуле . %с щ дрт « "стондаот. Д ) нссле4." носле* где Кнселед. - концентрация исследуемого препарата, вызывающая максимальный процент созревания в ряду возрастающих или убывающих концентраций, K д„„„- койцентрация стандарт* ного препарата, вызывающая максимальный процент соэре вания; ооцитов в ряду воэ растающих или убывающих

:концентраций;

882496

Ас „д р — гонадотропная активность стандартного препарата.

Фрагменты яичника рыб по 150200 ооцитов инкубируют в течение

48-53 ч при, 18-20оС на питательной среде Р 199 на растворе Хенкса с добавлением 12-16 различных концентраций исследуемого и стандарт,ного препарата с известной гонадот-! ,ропной активностью, вызывающих созревание не менее 2-3% ооцитов. Проводят подсчет созревших и несозревших ооцитов для каждой концентрации гормонов и устанавливают концентрации исследуемого и стандартного препаратов, вызывающие максимальный про- 15 цент созревания ооцитов в ряду последовательно убывающих или возрастаю. щих концентраций. Гонадотропную активность исследуемого препарата определяют по формуле 20 стандарт." стан*арт А

\ исс а*. " исслзд. где Keccneh концентрация исследуемого препарата, вызыва - 25 щая максимальный процент созревания в ряду возрастающих или убывающих концентраций;

К д„ддр,- концентрация стандартно- го препарата, вызывающая максимальный процент созревания ооцитов в ряду возрастающих.или убывающих концентраций;

Qzz„ > - гонадотропная активность стандартного препарата.

При этом <стдндaр - (например, международного стандарта) может быть экспериментально установлена для данного тест-объекта один раз в любой 40 сезон года и в дальнейшем использоваться в течение ряда лет и в разные сезоны года как постоянная величина при расчетах гонадотропной активности.

Предлагаемый способ дает возмож- 45 ность судить о гоиадотропиой активности при достижении созревания всего лишь небольшого процента ооцитов. Испольэовани@ концентраций, вызывающих максимальный ответ ткани- 50 мишелин (процент созревания ооцитов), исключает влияние индивидуальной или сезонной чувствительности рыб (жйвотных) к гонадотропинам иа конечный результат биологического

55 т*тирования, тем самым повышая его точность, снижает трудоемкость, расширяет сезонные возможности биологического тестирования,за счет возможности использования самок с низкой чувствительностью к гонадотропнйм d0 гормонам, удешевляет применение способа эа счет сокращения количества используемых для тестирования .животных до 2-3 и отсутствия необходимости проведения при каждом 65 тестировании сравнения с действием стандартного препарата. Стандартный препарат является необходимым только для первого определения гонадотропной активности и в последующих опытах в другие сезоны года полученные данные могут быть использованы как уже известная величина.

На фиг. 1 изображено влияние различных концентраций лютеинизирующего гормона (ЛГ) крупного рогатого скота с активностью 2,7 ед/мг на созревание ооцитов вьюна с разной сезонной чувствительностью к этому гормону; на фиг. 2 — влияние различных концентраций хорионического гонадотропина (ХГ) с активностью

2500 м.е./мг на созревание ооцитов вьюна с различной сезонной и индивидуальной чувствительностью к этому гормону; на фиг. 3 — влияние различных концентраций препарата гипофиза карпа с активностью 140 м.е./мг на созревание ооцитов вьюна с различной сезонной и индивидуальной чувствительностью к гонадотропинам гипофиэа.

В конце сентября — начале октября (а), в январе (б) и в начале апреля (в) процент созревания ооцитов в зависимости от концентрации гормона различен (фиг. 1) и колеблется в разные сезоны года от 2-5 до

70-90%. Однако максимальная реакция (процент созревания ооцитов) наблюдается только при строго определенной концентрации гормона (0,6 мг/мл).

Аналогичная закономерность наблюдается и внутри каждого сезона года в отношении индивидуальной чувствительности отдельных рыб, т.е. максимальная реакция (процент созревания ооцитов) наблюдается только при строго определенной концентрации гормона (0,6 мг/мл).

В конце сентября-начале октября (а), в январе (б) и в апреле (в) процент созревания ооцитов в зависимости от концентрации ХГ различен (фиг. 2) и колеблется от

2-8 до 70-90% в разное время года и у отдельных животных. Однако максимальная реакция (процент созревания ооцитов) наблюдается только при строго определенной концентрации гормона (80 м.е./мл).

В конце сентября-начале октября (а), в январе (б) и в апреле (в) процент созревания ооцитов в зависимости от концентрации препарата гипофиэа различен (фиг. 3) и колеблется от 2-8 до 70-90% в разное время года и у отдельных животных.

Однако максимальная реакция (процент созревания ооцитов) наблюдается только при строго определенной концентрации препарата (0,4 мг/мп или 56 м.е./мл).

Пример 1. Яичники, взятые от только что,декапитированной рыбы, 882496 разделяют на фрагменты по 150 ооцитов в каждом. В каждый из 24 бюксов диаметром 45 мм помещают по одному фрагменту яичника и добавляют 5 мл питательной среды Р 199 на растворе

Хенкса, содержащей определенную концентрацию исследуемых гипофизов карпа 111-й стадии зрелости или стандартный препарат гипофизов карпа lу-й стадии зрелости с активностью

140 м.е./мг. В 12 бюксах создают концентрацию стандартного препарата, мг/мл: 1,4р 1,2; 1,1; 1,0; 0,9; 0,8; соответственно, м.е./мл: 196, 168, 154; 140; 126; 112; 98; 84; 70; 56;

42 и 28, а в других 12 бюксах создают концентрации исследуемого препарата гипофизов карпа 111-й стадии зрелости, мг/мл: 1,4; 1,2; 1,1; 1,0;

0,2. Инкубацию ооцитов с гормонами проводят в течение 48 ч при 18ОС.

Через 48 ч инкубации ооцитов анализируют влияние каждой концентрации исследуемого и стандартного препаратов на созревание ооцитов вьюна, т.е. проводят подсчет созревших и несозревших ооцитов и вычисляют процент созревания. Устанавливают концентрации исследуемого и стандартного препаратов, вызывающие наиболее значительный процент созревания ооцитов, который наблюдается (фиг.3) при концентрации стандартного препарата 0,4 мг/мл или соответственно

56 м.е./мл и при концентрации препарата гипофизов карпа ill-й стадии зрелости 0,9 мг/мл ° .Исходя из соотношения стандаРт." " тан*аРт.

A исс лед; "исслед.

О 4 40

A асс ле*. — 0 9 — 62, 2 м.е. /м

У

Пример 2. Яичники, взятые от.только что декапитированной рыбы, разделяют на фрагменты по 200 ооцитов в каждом. В каждый иэ 32 бюксов диаметром 45 мм помещают по 2 Фрагмента яичника и добавляют по 5 мл питательной среды Р 199 на растворе

Хенкса, содержащей определенную концентрацию исследуемого препарата ХГ или стандартного препарата ХГ с установленной активностью 1000 м.е./мг.

В 16 бюксах создают концентрации стандартного препарата, м.е./ьИ: 40;

50; 6О; 70; 80; 90; 1ОО; 110) 120;

140у 160; 200; 240) 280; 320g 360 или соответственно, мг/мл: 0,04;

0,05; 0,06; 0,07у 0 08у 0,09

0,24g 0,28; 0,32; 0,36. В 16 других бюксах создают концентрации исследуемого препарата ХГ, мг/мл: 0,04;

0,05; 0 06; 0 07; 0,08; 0,09 0,10(0,28; 0,32р 0,36. Инкубацию ооцитов г

45 ших и несозревших ооцитов и вычисляют процент созревания. Устанавливают концентрацию препарата, вызывающую наиболее значительный процент созревания ооцитов в данных условиях, она равняется 0,03 мг/мп., Максимальная реакция на гонадотропный гормон (процент созревания ооцитов) независимо от индивидуальной и сезонной чувствительности животных наблюдает ся только при строго определенной концентрации гормона (стандартного

50 препарата). Для данного определения активности исследуемого препарата ХГ можно испольэовать параметры тестирования стандартного препарата (пример 2), проведенного несколько месяцев назад на другой группе рыб с иной чувствительностью ткани-мишени к гонадотропному гормону.

Подставляем в Формулу

"стан а х Аьтан*аРт необходиж е

"йсслв4,= . К «z«e*. б0 параметры стандартного пре арата ХГ с гормонами проводят в течение 53 ч при 20 С. Через 53 ч инкубации ооцитов анализируют влияние каждой концентрации исследуемого и стандартного препаратов на созревание ооцитов вьюна, т.е. проводят подсчет созревших и несозревших ооцитов и вычисляют процент созревания.

Устанавливают концентрации исследуемого и стандартного препаратов, вызывающие наиболее значительный процент созревания ооцитов. Наиболее значительный процент созревания ооцитов вызывает концентрация стандартного препарата 0,08 м/е./мп или соответственно 80 м;е./мл и концентрация исследуемого препарата ХГ 0,12 мг/мл.

Исходя из соотношения с панДаРт, стинДаРт.

) получаем ис ле К иселе*

О 08xl000 -666 м.е./мг

11ссле*.

Пример 3 (отсутствие в данное время стандартного препарата).

Яичники, взятые от только что декапитированной рыбы, разделяют на фрагменты по.200 ооцитов в каждом. В каждый иэ 16 бюксов диаметром 45 мм помещают по два фрагмента яичника и добавляют по 5 мл питательной среды Р 199 на растворе Хенкса,содержа30 щей определенную концентрацию иссле-. дуемого препарата ХГ.В 16 бюксах создают концентрацию препарата ХГ,мг/мп

0,02; 0,03; 0,04; 0,05) 0,06; 0 07;

35 0,14; 0,1бу 0,18у 0,20. Инкубацию ооцитов с гормонами проводят в течение 48 ч при 19 С. Через 48 ч инкубации ооцитов анализируют влияние каждой концентрации. исследуемого

40 препарата на созревание ооцитов вьюна, т.е. проводят подсчет соэрев882496

f0 с активностью 1000 м.е./мг иэ примера 2 и получаем !

0 08zl000

Aug е,= = 2666 м.е./мг

0,03

И пользование предлагаемого изобретения позволяет повысить точность и экономичность способа, снизить его трудоемкость, расширить сезонные возможности биологического тестирования эа счет использования самок рыб с низкой чувствительностью к Fo» надотропным гормонам и отсутствия необходимости проведения при каждом тестировании сравнения с действием стандартного препарата.

Формула изобретения

Способ определения гонадотропной активности гипофизов риб путем обработки культуры тканей ооцитов рыб в.питательной среде стандартным и определяемым растворами гормонов с последующей инкубацией при температуре 18-20 С и определением количества созревших ооцитов, о т л и ч а юшийся .тем, что, с целью повышения точности, обработке подвергают культуру тканей ооцнтов самок рыб с низкой чувствительностью к гонадот.— ропным гормонам, инкубацию проводят до .появления 2-3Ъ созревших ооцитов, а гонадотропную активность гормонов рыб определяют по Формуле стан ает.

М . )(А ис леВ.

К©щн ер - — концентрация. стандарт" ного препарата, визывающая максимальный процент созревания ооцитов в ряду возрастающих или убывающих концентраций

А,щ срг- гонадотропная активность стандартного препарата.

Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе

1. Веригин В.В. и др. Опыт определения активности гипоФизов. Вопросы ихтиологии, т. 11, вып. 6, 1971, с, 1014-1026.

882496 а М

° Ф 20

Г фЮ

Фэ g

О. З ОМ ОУ ОЕ а 1 аВ О.У гя (1 Q О К(ме/мл)

61 аг о.3 и и ию k7, 08 м f,î р и р к(т)мю) и al 63 о,9 as о,6 Ф7 е,э ае <0 ?? 1.3 ??(????>

Qifl4 1

882496

И N(wc мл

О,б

1.0

0В ф g fee/ил) 12

1,О

0.6

0,В

0,2

О,Ч

14 К (мв/ил) - l2

1О

О,S

ООУ 02

О,Ч

Фиг,.3 .

Составитель Е. Лебедюк

Редактор H. Альшина Техред И.Гайду Корректор M. немчик

Заказ 10024/4

Тираж 703 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород,-ул. Проектная, 4