Способ получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными 5 @ -гидроксильными группами

Способ получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными 5 @ -гидроксильными группами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

E,В.Митрофанов, А.П.Кавуненко,. Э.A. 1Тяйвинен, Н.Г.Краснопевцева и Н.С.Сидорова

1

Ордена Трудового Красного Знамени институт высокомолекулярных соединений АН СССР и ордена Ленина и ордена Трудового

Красного Знамени Ленинградский государственный университет им. А.А.Жданова (72) Авторы изобретения (7l) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЦЕТИЛИРОВАННЫХ РИБОНУКЛЕОЗИДОВ

СО СВОБОДНЫМИ 5 -ГИДРОКСИЛЬНЫМИ ГРУППАМИ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными 5 -гидроксильными группами, являющихся промежуточными соединениями для получения олигорибонуклеотидов заданной структуры с природной межнуклеотидной связью, обладающих биологической активностью.

Известен способ получения ацетилированных рибонуклеозидов со свобод1О ными 5 -гидроксильными группами (напl ример, 2, 3 -ди-0-ацетилуридина) ферментативным дефосфорилированием полностью ацетилированных рибонуклеозид-5 -фосфатов (2,3,ди-0-ацетилуридин- 5

-5 -фосфата) в присутствии щелочной фосфатазы в буферных растворах (в

0,2 М трис-НС1 буфере с рН 8) при

37 С в течение ч.

Целевой продукт выделяют бумажной хроматографией в системах изопропанол;конц, NH OH-H О (7: 1: 2), ВиОНАсОН-Н20 (5: 2: 3) . (Данные об активности фермента отсутствуют, используется коммерческий препарат) (1).

Недостатками этого способа явля" ются:. а) необходимость проведения процесса в области щелочных рН, где защитныв ацетильные группировки лабильны, что приводит к загрязнению целевого продукта продуктами частичного гидролиза ацетильных групп;

á) использование щелочной фосфатазы - внутриклеточного фермента, очист ка которой представляет содеи трудо" емкий и многостадийный процесс, не гарантирующий чистоты препарата, в) применение бумажной хроматографии для выделения целевого продукта

"что делает метод малопригодным для препаративного получения целевого продукта.

Цель изобретения — повышение качества целевого продукта и упрощение процесса.

883055

Эта цель достигается тем, что согласно способу получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными 5 -гидроксильными группами, ферментативное дефосфорилирование полностью ацетилированных рибонуклеозидl

-5-Фосфатов ведут в присутствии кислой фосфатаэы 1 иэ Saccharomyces cereviз1ае при рН 3,6-3,8 в растворе

0,05-0,1 M ацетата аммония, предпоч- 10 тительно е присутствии 0,8-30 ед. ферментной активности фосфатазы на

1 ммоль полностью ацетилированного рибонуклеозид-5 -фосфата, предпочтительно в течение 40 мин-25 ч, пред- ts почтительно при 20-37ОС в выделении целевого продукта хроматографией осуществляют на сефадексе LH-20 при соотношении высоты и диаметра колонки 15-20:1, соотношении нуклеозида и сорбента l ммоль: 100-105 мл, при этом элюцию ведут водой.

Существенными отличиями способа являются использование кислой фосфатазы из Saccharomyces cerevisiae ys в вышеуказанных условиях и применение для очистки целевого продукта колоночной хроматографии.

Использование способа получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными гидраксильными группами поэволяет„получить целевой продукт, не загрязненный продуктами разложения, а применение в способе колоночной хро;матографии для очистки целевого про- дукта упрощает способ и позволяет применить его для препаративного получения продукта °

Пример I. Раствор ммоль

6-й 2,3 -0-триацетиладенозин"5-фосфата в 50 мл 0,1 И ацетата аммония с рН 3,8 инкубируют с 0,8 ед.ф рментной активности кислой фосфатазы 1 иэ с

Saccharomyces cerevi iae при 37 С в течение 22 ч. За единицу ферментной активности применяют такое количество фосфатазы, которое дефосфолирует мкмол и-нитрофенилфосфата за !мин при 37 С и рН 3,7. Раствор упаривают в вакууме до объема 1 мл и наносят на колонку с сорбентом сефадекс LH-20 объемом 100 мл. Колонку промывают дистиллированной водой со скоростью "

25 мл/ч. Фосфатазу вымывают с 34 по

А0 мл элюата, что показано наличием в

SS элюате дефосфорилирующей активности.

Ацетат аммония вымывают с 53 по 65 мл элюата, что установлено по электропро. водности, 6-N, 2, 3 -О-триацетил,аденозин вымывают с 67 мл элюата, контроль ведется методом УФ-спектроскопии на длине волны 260 нм. Конечный продукт ведется лиофилизацией.

Выход 390 мг, т.е. 934 от теории.

Строение полученного продукта подтверждено анализом числа ацетильных групп в расчете на одну молекулу триацетильного производного рибонуклеоэи-да. Найдено 2,98 ацетильных групп на молекулу рибонуклеозида. Методом хроматографии на бумаге в системе бутанол-этанол-вода (4:1:5) не обнаружено следов других продуктов.

Пример 2. Процесс ведут в условиях примера 1, однако 1 ммоль 6-N,2,3 -0-триацетиладеноэин-5 -фосфата растворяют в 60 мл 0,05 M ацетата аммония с рН 3,6 и инкубируют в присутствии 2 ед. Ферментной активности кислой фосфатазы при 20 С в течение 25 ч. Конечный продукт выделяют лиофилизацией. Выход 398 мг, т,е. 953 от теории. При этом не найдено следов других продуктов.

Пример 3. Процесс ведут в условиях примера 1, однако 1 ммоль 6-й, 2, 3 -0-триацетиладейоэин-5 — фосфата растворяют в 50 мл 0,08 M ацетата аммония с рН 3,7 и инкубируют с 4,5 ед. Ферментной активности кислой фосфатазы в течение 5 ч. Выход

397 мг, т.е. 953 от теории. При этом не обнаружено следов других продуктов.

Пример 4. Процесс ведут в ус ловиях примера 3, однако 1 ммоль 6-М 2 3 О-триацетиладенозин=5 -фосфата

l инкубируют с 30 ед.ферментной активности кислой фосфатаэы в течение 40 мин.

8<><4 379 мг т е 904 от теории

Следов других продуктов не обнаружено

Пример 5. Процесс ведут в условиях примера 1, однако инкубации подвергают 1 ммоль 2-М, 2,3 -О-триацетилгуаноэин-5 -фосфата. Получают

372 мг,.т.е. 913 2-N,2,3 -0-триацетилгуаноэи а. Строение полученного продукта подтверждено анализом числа ацетильных групп в расчете на одну молекулу триацетильногс производного рибонуклеозида. Найдено 2,96 ацетильных групп на молекулу рибонуклеозида. Иетодом хроматографии на бумаге не обнаружено следов других продуктов.

П р и и е р 6. Процесс ведут в условиях примера 1, однако инкубации подвергают 1 ммоль 2,3 -0-диацетилуридин-5 -Фосфата. Получают

3055

Формула изобретения

Составитель Л.Никулина

Редактор Т.Кугрышева Техред И.Гайду Корректор О.Билак

Заказ 10114/32 Тираж 400 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,N-35, Раушская наб.,д.4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная,4

5 88

316 мг, т.е. 963 2,3 -0-диацетуридина. Строение полученного продукта подтверждено анализом числа ацетильных групп в расчете на одну молекулу диацетильного производного рибонуклеозида. Найдено 2,01 ацетильных групп на молекулу нуклеозида. Мето.дом хроматографии на бумаге не обнаружено следов других продуктов.

Способ получения ацетилированных рибонуклеозидов со свободными 5 -гидроксильными группами ферментативным дефосфорилированием в буферных растворах полностью ацетилированных рибонуклеозид-5 -фосфатов в присутствии фосфатаз, с последующим хроматографическим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта и упрощения процесса, дефосфорилирование ведут в присутствии кислой фосфатазы 1 из Saccharomyces cereviз1ае при рН 3,63,8 в растворе 0,05-0,1 И ацетата аммония, а хроматографическое выделение целевого продукта осуществляют на колонке с сефадексом LH-20 при соотношении высоты,и диаметра колонки з 15-20:1, соотношении нуклеозида и сорбента 1 ммоль : 100-105 мл, при этом элюцию ведут водой.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что ферментативное

lO дефосфорилирование осуществляют в течение 40 мин-25 час.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что ферментативное дефосфорилирование проводят при 2037 С.

4. Способ по п.l,î ò ë è ÷ à þшийся тем, что фермвнтативное дефорфорилирование проводят в при2в сутствии 0,8-30 единиц ферментной активности фосфатазы на 1 ммоль полностью ацетилированного рибонуклеозид-5 -Фосфата.

Источники информации, и принятые во внимание при экспертизе

Т.йс Иа, Y. Tàkåda, Н.Hayatsu.

"0n the Synthesi s of Uridi lуi --(3 5 )

-uridine Chem. Pharm. Bul l..,,12, 1503-1509 (1964) (прототип) .