Способ получения аффинного сорбента

Способ получения аффинного сорбента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(iii883060

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт, с вид-ву— (22) Задавлено 18. 01. 80(21) 2898691/23-05 с присоединением заявки М (23) Приоритет(51)M. Кл.

С 08 В 37/00 еооударствениый комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 23118" ° Бюллетень М 43

Дата опубликования описания 23.11.81 (53) УДК 661.183. .123(088.8) f"=

С.H.Çàãðåáåëüíûé и Ю.П.Зернов (72) Авторы изобретения

Специальное конструкторско-технологическое бюро биологически активных веществ Главного управления микробиологической промышленности щит Совете

Министров СССР (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯФФИННОГО СОРБЕНТА

Изобретение относится к областй биохимии и может быть использовано в аффинной хроматографии для выделения аденозинтрифосфат (АТФ)-зависимых ферментов.

Известен способ получения аффин5 ного сорбента путем введения ароматического кольца в BrCN-активированную сефарозу, получения 8-амина-АТФ и присоединения последнего азосоче10 танием к матрице, содержащей ароматическое кольцо I1).

Недостатками известного способа являются многостадийность процесса, использование труднодоступных и дорогих реактивов, употребляемых при введении ароматического кольца и азосочетании (например, N-сукцинимидный эфир бензойной кислоты, палладиевый катализатор), а также взрывоопасных (NaN0g) и высокотоксичных (HNOg) соединений.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаем му является способ получения аффинного адсорбен-, та, заключающийся в бромировании аденозинмонофосфата (АМФ) .до 8Вг-ЯМФ (с выходом последнего приблизитепьно 75/), автоклавировании 8Вr-ЯМФ при

140 С в присутствии гексаметилендиамина (выход 8(6-аминогексил) амино АМФ составляет 85:;), последующей защите алифатической аминогруппы 8— (6-аминогексил) амино-АМФ обработкой этиловым эфиром трифтортиоуксусной кислоты, активировании фосфатной группы нуклеотида путем обработки высушенного продукта упариванием с абсолютным пиридином АМФ карбонилдиимидазолом в сухом диметилформамиде, добавлении к активированному продукту неорганического пирофосфата до образования 8(CFg-С-ИН(СНо)ь1l

О

-NH) АТФ, снятии защиты с алифатической аминогруппы обработки 8 (CF

-С-NH(CH@) -NH) АТФ 1 М щелочью и о

883060

20 присоединением полученного 8-(6-аминогексил) аминоаденозинтрифосфата к

BrCN-активированной сефарозе (2).

Недостатками способа являются многостадийность процесса, низкий выход продукта, использование дефицитных и дорогих реагентов (карбонилдиимидазол, этиловый эфир, трифтортиоуксусная кислота), использование безводных растворителей, таких как пиридин и диметилформамид, и необходимость работы с ними в условиях, исключающих попадание влаги, что требует специальных мер безопасности.

Цель изобретения — упрощение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения аффинного сорбента, включающему обработку производного аденозина и присоединение полученного в результате обработки 8-(6-аминогексил)аминоаденозинтрифосфата к BrCN-активированной сефарозе, в качестве производного аденозина используют динатриевую соль аденозинтрифосфата и обработку проводят насыщенной бромной водой до получения .8-бромаденозинтрифосфата и затем гексаметилендиамином в присутствии эквимолярной смеси иодистого калия и сульфата меди в качестве катализатора в течение

4-6 ч при 40-50 С.

Сущность предлагаемого способа получения аффинного сорбента заключается в следующем.

Динатриевую соль АТФ обрабатывают насыщенной бромной водой до получения 8 Br-АТФ. Продукт реакции выделяют ионообменной хромотографией на

ДЭАЭ-сефадексе, Готовят реакционную смесь, содержащую 8Br-АТФ, гексаметилендиамин, смесь CuSOg и KJ, выдерживают 4-6 ч при 40-50 C. О полноте прохождения реакции судят по сдвигу максимума поглощения реакционной смеси с 260 нм до 280 нм. Продукт реакции выделяют ионообменной хроматографией на

ДЭАЗ-целлюлозе.

Полученный 8- (6-аминогексил) амино-АТФ выдерживают в течение 16 ч с

BrCN-активированной сефарозой, Продуктом реакции является сорбент, содержащий АТФ, ковалентно присоединенный через С-8 положение.

Пример 1, Синтез 8Br-АТФ, 1 ммоль (551 мг) АТФ (натриевая соль

4

РаствоРЯют в 40 мл 1 M СН СООНа (рН 4,0), добавляют 10 мл насыщенной бромной воды. Реакционную смесь оставляют при комнатной температуре в темном месте

Добавляют Na до обесцвечивания раствора. Реакционную смесь упаривают до масла, растворяют в 50 мл

Н00 и наносят на колонку (1,6х70 см) с ДЭАЭ-сефадексом A-25 (в НСО9 -форме)

Промывают колонку линейным градиентом (0,1-0,4 И ) триэтиламмоний дикарбоната (ТЭАБ) рН 7,5. Скорость элюирования 90 мл/час, объем элюата 1,8 л. Фракции, .соответствующие

8Br-АТФ, объединяют и упаривают на ротационном испарителе. Остаток

ТЭАБ удаляют повторным упариванием с водным этанолом.

Выход OBr-АТФ составляет

0,75 ммоль (75 ) .

Синтез NH <(CH ) 6 NH-АТФ. О, 75 ммоль

8Вг-АТФ растворяют в 10 мл Н О, добавляют 5 .г ИНg(CHg) 6МН g, 20 мг

CuS0< и 20 мг K I Выдерживают реакционную смесь 4 ч при 50 С. О полноте прохождения реакции судят по сдвигу максимума поглощения реакционной смеси с 260 нм до 280 нм. Реакционную смесь разбавливают дистиллированной водой до 500 мл и наносят на колонку (2,6Х70 см) с ДЭАЗ целлюлозой (в НСО -форме) . Скорость нанесения 90 мл/час. Промывают колонку линейным градиентом(0,1- 0,5 M)

ТЭАБ рН 7,5. Скорость элюирования

60 мл/ч, объем элюата 1,5 л фракции, соответствующие 8-(6-аминогексил) амино-АТФ, объединяют и упаривают на ротационном испарителе. Остаток ТЭАБ удаляют повторным упариванием с водным этанолом.

Выход NH<(CH>)6 МН-АТФ составляет

0,41 ммоль (554) .

Пример 2. 0,75 ммоль 8Вг-АТФ растворяют в 10 мл Н10, добавляют 5 r NHy(CHg)

20 мг Kl. Выдерживают реакционную смесь 6 ч при 400С. О полноте про-, хождения реакции судят по сдвигу максимума поглощения реакционной смеси с 260 нм до 280 нм. Реакционную смесь разбавляют дистиллированной водой до 500 мл и наносят на колонку (2,6Х70 см) с ДЭАЭ-целлюлозой в (НСО -форме) . Промывают колонку линейным градиентом (0,1- 0,5 M) ТЭАБ рН 7,5. Фракции, соответствующие

8- (6-аминогексил) амино-АТФ, объединя883060

Формула изобретения

Составитель Г ° Русских

Редактор Т.Кугрышева Техред И Гаиду Корректор О.Билак

Заказ 10115/32 Тираж 533 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,Ж-25, Раушская наб.,д 4/5

Филиал ППП "Патент". r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ют и упаривают на ротационном испарителе. Остаток Т3А6 удаляют повтор" ным упариванием с водным этанолом.

Выход NH (СНg) NH-АТФ составляет

0,29 ммоль (65 0)

Присоединение NH g (CH g) 6 NH АТФ к

BrCN-активированной сефарозе ° 9 г сухой ВгСМ-активированной сефароэы промывают на фильтре 300 мл холодной

0,001 NHCl, затем 100 мл холодного

0,1 М Ма СО (рН 9,5) и переносят в колбу. Добавляют 5 мл раствора (30 ммоль) МН (СН2) NH-АТФ в 0,5 M

Na C0g (рН 9,5) .Перемешивают 16 ч при 4 С. Промывают сорбент О, 1 М

Na gC0 g (pH 9, 5) до отсутствия оптической плотности и затем водой до нейтрального значения рН, Выход сорбента составляет 9 г.

Емкость сорбента 3 ммоль АТФ на 1 г сухого носителя.

Использование предлагаемого способа получения аффинного сорбента по сравнению с известным позволяет сократить число стадий получения аффинного сорбента, исключить трудоемкую стадию автоклавирования, требующую специального оборудования, и стадии, связанные с необходимостью работать с безводными растворителями улучшить условия труда за счет исключения из процесса токсичных реагентов (таких как пиридин, диметилформамид), а также разместить процесс на обычном производстве органического синтеза без особых требований к оборудованию помещения и беэ специальных мер по технике безопасности, эаменить дефицитные реактивы на более доступные коммерческие препараты, увеличить выход целевого продукта °

Способ получения аффинного сорбента, включающий обработку произ о водного аденозина и присоединение полученного в результате обработки

8-(6-аминогексил)аминоаденозинтрифосфата к BrCN-активированной сефарозе, отличающийся тем, что

t5 с целью упрощения способа и увеличения выхода целевого продукта, в качестве производного аденозина используют динатриевую соль аденозинтрифосфата и обработку проводят насышенной бромной водой до получения 8-бромаденозинтрифосфата и затем гексаметилендиамином в присутствии эквимолярной смеси иодистого калия и сульфата меди в качестве катализатора в течение 4-6 ч при 40-50 С, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. G.W.К;Kuntz et:.аl. Isolat!on of

Phosphoglycerate kinases by АН1пi.ty

Chromatography, European Уournal

of Biochemistry, 1978,V 85, ii 2, р.493-501.

2.Jau P, Trayer et al. Preparativu и of Adenosirle Nucleotide Derivatives Suitable for, Affinity. Chromatography, The Biochemical Jorna1. 1974, V 139, Г 3, р. 609-623 (прототип),