Способ получения иммобилизованной лакказы

Способ получения иммобилизованной лакказы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

—

Знамени и ордена Октябрьской Революции государственный университет им. M В. Ломоносова (7! ) Заявнтель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМИОБИЛИЗОВАННОЙ ЛАККАЗЫ

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения иммобилизованной лакказы.

Лакказа — фермент, относящийся к классу оксидаз, катализирующий процесс переноса электронов с органических субстратов на молекулярный кислород.

С использованием ферментов этого класса, в частности лакказы, связывают возможность создания кислородного

10 электрода биохимического топливного элемента.

Известны способы получения иммобилизованной лакказы адсорбцией на конка- 15 навалин-А-сефарозе и ковалентным связыванием с сефарозой, активированной бромцианом (1).

Однако поскольку себароза и конканавалин-А-сефароза не обладают элект- о ронной проводимостью, указанные препараты лакказы не могут быть использованы для катализа электрохимических процессов.

Известен способ получения иммибилизованной лакказы адсорбцией на элект тронопроводящем носителе — саже (2).

Однако в процессе иммобилизации фермент теряет 80Х исходной активности, а полученный этим способом препарат иммобилизованной лакказы отличается невысокой термостабильностью (константа скорости его инактивации втрое больше по сравнению с нативным ферментом) .

Цель изобретения — повышение активности и термбстабильности иммобилизованной лакказы.

Поставленная цель достигается тем, что электронопроводящий носитель— сажу предварительно обрабатывают бычьим сывороточным альбумином (БСА), после чего осуществляют связывание лакказы с носителем в присутствии, так называемого, реагента Вудворда - NI

-этил-5-фенил-изоксазолий — 3 -сульфоната.

Формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Редактор И. Николайчук Техред А, Бабинец Корректор Г ° Решетник

Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )K-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 10124/37

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул . Проектная, 4

3 8831

При этом предпочтительно указанный реагент Вудворда использовать в 5-8кратном избытке (по весу1 по отношению к лакказе. (Наилучшие результаты

90 "oão сохранения первоначальной ак% тивности получают при 5-кратном избытке реагента Вудворда по отношению к лакказе. При увеличении этого соотношения активность полученного препарата умень. шается и при 20-кратном избытке реак- 1О тива Вудворда составляет 59 от первоначальной активности).

Термостабильность полученной иммобилизованной лакказы в интервале тем— пературы 20-65 С не отличается от стао бильности нативного фермента. Активность иммабилизованной лакказы может достигать 90 от исходной.

Пример. 4 мг предварительно измельченной сажи МП-100 суспендируют в 0,5 мл дистиллированной воды, содержащей 3 мг БСА. Суспензию перемешивают в течение часа, а затем центри. фугируют в течение 10 мин при 6000 g.

Супернатант отделяют и осадок промывают 4-5 раз дистиллированной водой.

К полученной саже с адсорбированным БСА добавляют 0,5 мл раствора лак.1О казы в воде, содержащей 8,7- 10 моль (0,05 мг) фермента, затем 0,4 мг ре- 3g агента Вудворда. Полученную су8пензию выдерживают в течение часа, после чего осадок отделяют центрифугировани— ем и промывают О,1 М фосфатным буфером с рН 6,0. Полученный препарат со— храняет 90 исходной активности.

Таким образом, получают электронопроводящий стабильный препарат иммобилизованной лакказы, обладающий высокой активностью. Лакказа, иммобилизованная на саже предлагаемым способом, может быть использована для из72 ф готовления электродов биохимических топливных элементов, Создание электродов на основе окислительно-восстановительных ферментов, иммобилизованных на электронопроводящем носителе, создает реальные предпосылки для разработки биохимических источников така высокой мощности, Кроме того, лакказа, иммобилизованная на саже, может быть использована для создания чувствительных сенсоров для количественного определения органических соединений, являющихся субстратами лакказы.

1. Способ получения иммобилизованной лакказы путем связывания фермента с электронопроводящим носителем — сажей, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и термостабильности целевого продукта, сажу предварительно обрабатывают бычьим сывороточным альбумином, а свя— зывание с ферментом осуществляют в присутствии М вЂ” этил — 5-фенил †изоксазо/ лий-3 -сульфоната.

2. Способ по п. 1, а т л и ч а ю шийся тем, что М-этил †5 †фенил— изоксазолий-3 -сульфанат используют в 5-8-кратном избытке (по весу) по отношению к лакказе.

Источники информации, принятые ва внимание при экспертизе

1. Stan1еу С. Frocher, К. Е. Er1ksson Свойства гликопротеина лакказы, иммобилизованной двумя методами. Acta

Chem. Scand.,1Â 29, 1975, р. 691-694.

2. Авторское свидетельство СССР по заявке Р 2791581/26, кл. С 25 В 11/12, 1979 (прототип)