Способ получения иммобилизованной липазы

Способ получения иммобилизованной липазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскик

Сон1ивпистическии

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (и>883173 (6! ) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 03.12. 79 (21) 2846845/23-04 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 23. 11, 81 . Бюллетень № 43 (51)M. Кл.

С 12 М 9/18

С 12 N 1/08

3Ьсудерстееиный комитет

СССР во делам изабретени!! и стирытий (53) УДК577. 15. .07(088.8) Дата опубликования описания 23. 11.81 (72) Авторы изобретения

И. М. Рахимов, P. P. Авлянова и Н. P. Землянская

Среднеазиатский научно — исследовательский и проектноконструкторский институт пищевой промышленности (71) Заявитель (54) СПРОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ

ЛИПАЗЫ

0Н N0

Изобретение относится к технической биохимии, в частности к способам получения иммобилизованной липазы.

Известен способ получения иммобилизованной липазы, включающий обработку полиамидного носителя (капрон) би—

5 функциональным реагентом, в качестве которого используют глутаровый альдегид, при щелочных значениях рН, температуре О С и весовом соотношении о глутаровый альдегид: носитель (О, 3810

0,39): 1 и связывание липазы с полученным носителем также при щелочных значениях рН.

Обработку носителя глутаровым аль15 дегидом обычно проводят при рН 8,5 в течение часа, а связывание с ферментом — при 4 С в течение 12 ч 1), Однако для данного способа харак.терна недостаточно высокая активность и термостабильность получаемого про". дукта.

Достигаемая удельная активность

0.8 ед/г (хлопковое масло) и 213 ед/г

2 (трибутирин), соотношение активности иммобилизованного и растворимого фер.ментов составляет 0,66 и 0,01 (соответственно на указанных субстратах).

Время полуинактивации при 50 С состав" ляет 2,5 ч (за час иммобилизованный фермент теряет 20Х активности).

Цепью изобретения является повышение активности и термостабильности иммобилизованной липазы.

Указанная цель достигается тем, что в качестве бифункциональиого реагента используют госсипол формулы и обработку им носителя. ведут при ве"

eosoM соотношении соответственно (0,25

3,0);)00 и температуре 45-80 С, Кроме того, обработку ведут при рН 8,0-9, /А ВРемя полуИ P инакти ации при 50 С, ч

А /А

7$ Т

Удельная активность препарата, е// г

Сшивающий

Способ агент

Хлопко- Трибути вое мас- рин ло

Извест- Глутароный вый диальдегид О, 8

213 0,66 0 01

2,5

Пр едГоссилагаемый

3,5

250 0,77 0,17

14,0 пол

Растворимая липаза

323

П р и м е ч а н и е. А, А — удельные активности, измеренные с трибуТ6 тирином и хлопковым маслом, р — растворимый фермент, и — иммобилизованный;

А /А — отношение удельных активностей иммобилиM P зованных и растворимых липаз.

3 88 в течение 1-5 ч. При этом связывание липазы с носителем осуществляют при

0-16 С.

Активность фермента определяют по его способности расщеплять хлопковое масло и трибутирин.

Пример 1. 10 мг порошкообразного олиамида обрабатывают 4 í. HCl (1 мл) при 450С в течение 2 ч, затем промывают трижды дистиллированной водой (по 5 мл) . Осадок полиамида отделяют декантацией или центрифугированием (5 мин, 2000 об/мин) . К влажному осадку добавляют 2 мл раствора госсипола в 0,1 M Воратном буфере с рН

8,8 с концентрацией 0,05 мг/мл и выдерживают при 80 С в течение 1 ч. Избыток госсипола удаляют центрифугированием (5 мин, 2000 об/мин) с последующим промыванием осадка ацетоном(3 х 2 мл).

Для подсоединения фермента к модифицированному таким образом полиамидному порошку, его промывают 0,1 M боратным буфером с рН 8,8 (2 х 5 мл) и добавляют 1 мл раствора липазы с концентрацией 10 кг/мл и инкубируют в течение,!6 ч при 4 С. Полученный целевой

Из таблицы видно, что применение госсипола при прочих равных условиях позволяет повысить каталитическую BK

3173 4 продукт промывают 0,1 М боратным буфером, а затем дистиллированной водой °

Активность фермента измеряют по его способности расщеплять хлопковое масло.

Пример 2. Все операции проводят, как в примере l но концентрация госсипола 0,005 мг/мп, температура

45 С, время 5 ч.

lO При концентрации сшивающего агента 0,005; 0,01; 0,025; 0,05 мг/мл удельная активность (с хлопковым маслом) составляет 10,2; 14,0; 9,0 и

8,2 ед/г соответственно. !

5 При соотношении (по весу) сшивающего агента и носителя 0,25: 100;

0,5 : 100; 1 : 100; 2 : 100; 3 : 100 удельная активность соответственно

13,1; 13,5; 14,0; 13,7; 14,0 ед/г.

При рН среды 7 5; 8 0; 8 5; 8,8;

9,5 удельная активность соответственно 2,0; 7,0; 14,0; 13,7 и 5,0 ед/г.

В таблице приведены результаты сравнения каталитической активности и стабильности нерастворимой липазы> полученной по предлагаемому способу и известному. тивность. Кроме того, целевой продукт, полученный по предлагаемому способу, обладает высокой стабилhHocTbI0. Время

883173 Ь реагента используют госсипол — соединение формулы

S

ОИ

Формула изобретения lS

Составитель и. Скородумова

Редактор И. Николайчук Техред 3. Фанта Корректор Г.Решетник

Заказ 10124/37

Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета. СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г ° Ужгород, ул. Проектная, 4

5 полуинактивации при 50аС составляет

3,5 ч, вместо 2,5 ч, а при 20 С фермент может функционировать от 48 ч до

30 сут.

Таким образом, изобретение прэволя— ет повысить каталитическую активность иммобилизованного фермента в 1,5-2 раза и увеличить стабильность нерастворимой липазы, а следовательно, и lO длительность использования.

1. Способ получения иммобилизованной липазы, предусматривающий обработку полиамидного носителя — капрона бифункциональным реагентом, несущим альдегидные группы, в щелочной среде и связывание фермента с полученным носителем, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и термостабипьности целевого продукта, в качестве бифункционального

К сн НС(СН ) а обработку им носителя зедут при весовом соотношении соответственно (0,25-3,0) г 100 и температуре 45-80 С.

2. Способ по п. 1 о т л и ч а юшийся тем, что обработку носителя госсиполом осуществляют при рН 8,09,5 в течение 1-5 ч.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а— ю шийся тем, что связывание липазы с носителем осуществляют при 0-16 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Рахимов М. М. Джанбаева Н. Р, и Березин И. В. Субстратная специфичность иммобилизованных липаз. ДАН

СССР, 1976, т. 229, 11- 6, 1481-!486 (прототип).