Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы

Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

< >883175 (61) Дополнительное к авт. саид-ву— (22)Заявлено 25.07.79 (21) 2803362/23-04 с присоединением заявки рв (23) Приоритет

Опубликовано 23.11.8! . 61оллетень Юе 43

Дата опубликования описания 23 . 1 l .8 1 (51)М. Кл.

С 12 и 9/92

С 12 М 11/14

3Ъсудерстеенньб1 квинтет

СССР ао делам наебретеннй н открытий (53) УДК 577.15. . 07 (088. 8) И. В. Березин, А. M. Егоров, A. В. Ананичев, А. М. Безбородов и И. В. Улезло (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного

Знамени государственный университет им. M. В. Ломоносова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ

Г ПОКОЗОИЗОМЕРАЗЫ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения иммобилизованной глюкозоизомеразы, которая может найти применение для получения глюкозо-фруктозного сиропа из гидролизаторов крахмалосодержащего сырья для нужд пищевой промышленности.

Известно получение иммобилизованной глюкозоизомеразы различными способами, например путем ковалентного

10 связывания фермента с полимером, адсорбцией, включением в гель и т.д. 11)

Однако большинство известных препаратов иммобилизованной глюкозоизомеразы обладает или низкой активностью, 15 или мзлой стабильностью (время полужизни препаратов составляет от 42 ч до 40 дн.). Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения иммобилизованной клюкозоизомеразы путем связывания фермента в буферном растворе с неорганическим

Si — содержащим носителем (в качестве которого обычно используется пористое стекло) с помощью сшивающего агента— глутарового альдегида (2).

При иммобилизации сохраняется 567 первоначальной активности, препарат теряет половину активности в течение

30 дн.

Однако для известного способа ха-. рактерны недостаточно высокие значения активности и стабильности получаемого продукта.

Кроме того, глутаровый альдегид является ингибитором глюкозоизомеразы.

Применение глутарового альдегида в качестве сшивающего агента отрицательно сказывается на активности и стабильности получаемого препарата из-sa малой длины углеродной цепочки молекулы глутарового альдегида.

Целью изобретения является повьппение активности и стабильности полу- . чаемого препарата.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения иммо883175 х IO I Смесь инкубируют s течение

6 ч при 60 С при осторожном перемео шивании на роторе, осадок иммобилизованного фермента отделяют на стеклянном фильтре, промывают буфером до исчезновения глюкозоизомеразной активности в промывных водах, Полученный препарат сохраняет 62Х исходной активности, имеет рН-оптимум о

7,5; температурный оптимум 80 С. Через 3 месяца работы в реакторе с пео ремешиванием при 60 С препарат проявляет 56Х своей первоначальной активо ности. При хранении при 4 С в течение года активность препарата практически. не меняется. Скорость конверсии глюкозы во фруктозу для иммобилизованной глюкозоизомеразы составляет 11,3 мг

Фруктозы в час, что лишь ненамного ниже значения для растворимого фермента (12,1 мг/ч).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить стабильный препарат иммобилизованной глюкозоизомеразы, обладающий высокой ферментной активностью.

Формула изобретения

50 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Грачева И. N., Мосичев М. С. и Гавристова А. В. Глюкозоизомераза .микроорганизмов. Сборник "Итоги науSS ки. Микробиология", т. 9, М., 1978, ВИНИТИ, с. 69-74.

2. Lee Y, Y.,Wun К., Tsao G. Т. Kinetics and mass transfer chara— били зованной глюкозоиэомеразы путем связывания Фермента в буферном растворе с неорганическим Si-содержащим но" сителем с помощью сшивающего агента, в качестве последнего используют ква- % тернизованный сополимер винилпиридина с акролеином.

Кроме того, в качестве неорганического S i -содержащего носителя обычно используют аминированный силохром, а в !О качестве глюкозоимер азы — глюкозоизомеразу Actinomyces о! iчосinereus

154.

Использование в качестве сшивающегo агента кватернизованного сополи- !З мера винилпнридина с акролеином позволяет достаточно отдалить фермент от носителя и избегнуть отрицательного влияния матрицы.

Способ осуществляют следующим образом.

К аминированному силохрому добавляют водный раствор кватернизованного сополимера винилпиридина с акролеином в фосфатном буфере рН 7,6. К полученному продукту добавляют глюкозоизомеразу, соли магния и кобальта и инку— бируют в течение 6 ч при перемешивании. Иммобилизованную глюкозоизомера-: эу отделяют от раствора и хранят при

4 С в фосфатном буфере рН 7,6.

Полученный таким путем фермент сохраняет 58 — 62X первоначальной активности, имеет рН вЂ” оптимум 7,5 (рН оптимум нативного фермента 8,5) и со35 храняет через 3 месяца работы в реакторе с перемешиванием 56Х своей ако тивности. При хранении при 4 С в течение года препарат иммобилизованной глюкоэоизомераэы практически не теря40 ет активности.

Пример. 1 г аминированного

Я -аминопропилтриэтоксиланом макропористого силохрома (размер пор 700

IO0O А содержание аминогрупп

43

4,7 мг-экв/г) смешивают с 25 мп IX-oro раствора кватернизованного сополимера винилпиридина с акролеином в 0,05 N фосфатном буфере рН 7,6. Смесь осторожно перемешивают на роторе в течение 6 ч, затем носитель отмывают на стеклянном фильтре от несвязавшегося полимера тем же буфером до исчезновения в промывных водах поглощения при

255 нм. Полученный носитель с пришитым сополимером помещают в 60 мл

3,1Х-oro раствора глюкозоиэомеразы, содержащего MgS04 в концентрации

° 10 N и СоС! 2 в концентрации I x

1 . Способ получения иммобилизован

Б ной глюкозоизомеразы путем связывания фермента в буферном растворе с неорганическим Si-содержащим носителем с помощью сшивающего агента, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности получаемого препарата, в качестве сшивающего агента используют кватернизованный сополимер винилпиридина с акролеином.

2. Способ по п. !, о т л и ч а— ю шийся тем, что в качестве неорганического Si ñîäåðæàùåãî носителя используют аминированный силохром, 3. Способ по п. l о т л и ч а— ю шийся тем, что используют глюкозоизомераэа АсС!nomyces о!!vocinereus 154.

Составитель О. Скородумова

Редактор И, Николайчук Техред А.Ач Корректор Г. Решетник

Тирах 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 10124/37

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 883175 б

cter i st i cs of g l ucose i somerase im- 11, поЬ11!fed on porous glass "Immobi1 Й-т, e ta, S., Susuk i " Р! пнто 1 - Й.-У... р. 132-140 (протоmmo i i Й.-т, London, 1975 е- тнп) .