Способ получения стабилизированных ферментов,содержащих sн- группы

Способ получения стабилизированных ферментов,содержащих sн- группы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советсини

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ () )) 883176 (6 ) Дон ол н и тел ьное к а вт. с вид- ву— (22) Заявлено 25. 10. 79 (2! ) 2835139/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) П риормтет

Опубликовано 23.11 81. Бюллетень № 43 (51)М. Кл.

С 12 !)! 9/96

С 12 N 9/02

Гооударстасииый комитет

СССР ио делзн изабретеиий и открытий (53) УДК577. !5 °

° 07(088.8) Дата опубликования описания 23. 11. 8 1

И. В. Березин, M. М. Диков, А. М. Егор

А. Ю. Карулин, М. И. Мустафаев и А. (72) Авторы изобретения (7!) Заявитель

Московский ордена Ленина и ордена Труд

Знамени государственный университет им. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ, СОДЕРЖАЩИХ Sk-ГРУППЫ

Изобретение относится к энзимоло— гии, а именно к способам получения стабилизованных ферментов, которые могут быть использованы, например, в проточ— ных реакторах мембранного типа, в автоматических анализаторах биологических объектов и т. д.

Известен способ получения стабилизированных ферментов, содержащих SHгруппы, заключающийся в обработке фермента водорастворимым полимером — со- т полимером акролеина и 4-винилпиридина в присутствии кофакторов или субстратов. Процесс проводят при рН 7,5.

Полученные стабилизированные ферменты сохраняют до 90Х активности, стаfS бильность возрастает в 20-90 раз по сравнению с нативным ферментом(1 )

Недостатками способа являются невысокие значения активности и стабиль

20 ности получаемых ферментных комплексов; проведение реакции в присутствии больших количеств кофактора или субстрата фермента, так как при образовании ковалентных связей между альдегидными группами полимера и активными группамй фермента часть из них, ответственная за каталитическую активность, модифицируется, что приводит к снижению активности фермента.

Кроме того, необходимость поддерживать величину рН в очень узком определенном диапазоне 7 5 не всегда совпадает с оптимальной для активности величиной.

Цель изобретения — повьппение активности и стабильности получаемых стабилизированных ферментов.

Поставленная цель достигается согласно способу, заключающемуся в обработке фермента водорастворимым полимером на основе 4-винилпиридина, в частности, кватернизованным поли-4-виI нилпиридином при рН, соответству)ошем значению изоэлектрической точки фермента.

3 8831

Предпочтительно процесс ведут при мольном соотношении фермент: полимер (1-20) : 1.

Существенными отличиями способа являются; использование в качестве водорастворимого полимера на основе 4-винилпиридина кватерниэованного поли-4-винилпиридина и проведение процесса при рН, соответствующем изоэлектрической точке фермента.

Способ осуществляется следующим образом.

Проведение процесса при рН, соответствующем изоэлектрической точке фермента, связано с тем, что стабилизация происходит за счет образования электростатического комплекса ферментполимер .

Наблюдаемый эффект стабилизации обусловлен тем, что при комплексообразовании молекула полимера как бы

"опутывает" молекулу фермента, в результате чего вокруг молекулы фермента образуется положительно заряженная оболочка, препятствующая проникновению к молекуле белка ионов металлов, явля— ющихся катализаторами окисления существенных для активности SH-групп фермента, растворенным молекулярным кислородом. Наличие в молекулах полиЭО мера, описанного в известном способе альдегидных групп приводит помимо электростатического взаимодействия с фЕрментом, к образованию ковалентных связей между альдегидными группами носителя и NH -ãðóïïàìè (возможно так)5 же SH — группами) фермента, что вызывает снижение его начальной активности и быструю потерю активности на начальной стадии инактивации. Так как используемый в предлагаемом способе полимер не содержит альдегидных групп (в отличие от используемого известного полимера), то модификации фермента не происходит, и процесс комплексообразования не сопровождается потерей активности. Кроме того, общий положительный заряд полимерной молекулы без альдегидных групп с тем же молекулярным весом значительно больше, а следовательно, эффект экранирования 511 белковой глобулы заряженным полимером выше. чем в известном способе — в случае полимера с альдегидными группами.

Это обуславливает увеличение активности и масштаба стабилизации ферментов поли-ч-винилпиридином по сравнению с полимером, описанным в известном способе.

76 4

Образующийся электростатический комплекс фермента является прочным и не разрушается при высокой ионной силе раствора.

Описываемый способ получения стабилизированных ферментов позволяет полностью сохранять начальную активность SH-ферментов, а также более чем в 500 раз повысить их стабильность.

При этом процесс протекает без добавления субстратов и кофакторов при рН, оптимальных для действия ферментов.

Пример 1. К2мл03 10 M раствора формиатдегидрогеназы (мол. Вес

80000, уд. активность 10 ед/мг) в

0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 приливают 2 мл 0,3 10 5М раствора в том же буфере кватернизованного поли-4-винилпиридина (степень. алкилирования

100Х, мол. в. 40000). Иммобилизованный фермент полностью сохраняет свою активность. Стабильность комплекса, при 37 С, определяемая по кажущейся константе инактивации первого порядка, по глубине превращения 50Х возрастает в 500 раз. Иммобилизованная формиатдегидрогеназа теряет 50Х активности при

37 С в течение 800 ч, время полной инактивации нативного фермента 60 ч.

Лучший показатель для формиатдегидУ рогеназы, иммобилизованной по известному способу, полученный при проведении процесса в присутствии формиата

300 ч.

Синтез и фракционирование поли-4-винилпиридина проводят по методам, из-. вестным в литературе j2) (3).

Полимеризацию 4-винилпиридина осуществляют при перемешивании в толуоле, о не содержащем кислорода, при 50 С. Готовый продукт несколько раз промывают толуолом и бензолом и высушивают до о постоянного веса в вакууме при 40 С.

Фракционирование поли-4-винилпиридина проводят пробным осаждением в системе четвертичный бутанол-бензол. Используют узкую фракцию полимера. Кватернизацию поли-4-винилпиридина осуществляют бромистым этилом в метаноле при

60 С в запаянных ампулах под аргоном.

Пример 2. К 2 мр 3 !О М раствора формиатдегидрогеназы (мол. вес 80000, уд. активность

10 ед/мг) в 0,05 M фосфатном буфере рН 7,2 приливают 2 мл 5>10 М раствора в том же буфере кватернизованного поли-4-винилпиридина (степень алкили20

Формула. изобретения

Составитель О. Скородумова

Редактор Т. Киселева Техред Т. Маточка Корректор Г. Решетник

Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 10124/37 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 8831 рования 100Х мол. в. 900000). Активность фермента не изменяется.

Полученный комплекс теряет при ,о с

37 С половину активности в течение

1350 ч.

Пример 3. К 2мп 3 10Мра-5 створа апкогольдегидрогеназы иэ печени лошади (уд. активность 2 ед/мг1 в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,8 приливают .2 мл 3 1О М раствора в том же ф буфере кватернизованного поли-4-винилпиридина (100K алкилирование, мол. вес 40000).

Иммобилизованный фермент полностью сохраняет свою активность, Il

Полученный комплекс теряет половину активности при 37 С в течение 600 ч

3 в то время как нативный фермент полно- . стью инактивируется эа 30 ч.

1, Способ получения стабилизированных ферментов, содержащих SH- группы, 76 Ь обработкой фермента водорастворимым полимером на основе 4-вннилпиридина, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности получаемого продукта, в качестве водорастворимого полимера используют кватернизованный поли-4-винилпиридин, при этом процесс ведут при значениях рН, соответствующих изоэлектричес кой точке фермента.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юm и и с я тем, что процесс ведут при мольном соотношении фермент : Полимер (1-20) : 1.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

N - 662557, кл. С 07 G 7/02, 1976 (прототип).

2. Onductr. Eng Chem. 1950, 42, 1603 †l6.

3. G . Polymer. Sci 1956, 22, 463-476.