Штамм @ фу-79,продуцент l-амилазы и протеазы

Штамм @ фу-79,продуцент l-амилазы и протеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

<<ес 1а

«о885253

Союз Советсйих

Социалистических

Реслублик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 15. 07. 80 (21) 2956199/30-15 с присоединением заявки ¹â€” (53)М. Кл.з

С 12 Н 9/28

С 12 М 9/56

Государственный комитет

С СС P но делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 30.1181, Бюллетень NB 44

Дата опубликования описания 30,11,81 (53) УДК 577.156..577.154,31 (088. 8) (72) Авторы изобретения

Т. И. Иванова, А. С. Кривиский, Л. М. Ермакова

Г. В. Ставинская, В. A. Удовченко, А. П.Шарап

К.A.Êàëóíÿíö и В.М.Степанов (71) Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский инст и селекции промышленных микроорганинмон —— (54) ШТАММ BACILLUS SUBTILIS ФУ-79— ПРОДУЦЕНТ 3-АМИЛА1Ы И ПРОТЕАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения штаммов-продуцентов cC;àìèлазы и протеаэы.

Препараты, содержащие cL-амилазу и протеаэу, широко используются в народном хозяйстве в животноводстве, пищевой, текстильной, бумажной промышленности.

Лучшим иэ известных в настоящее время продуцентов *-амилазы, используемым в производстве, является штамм Вас.subtiiis ВНИИ генетика-44 (13.

Известно также, что некоторые штаммы бацилл продуцируют наряду с

d.-амилаэой щелочную и нейтральную протеазы L2j.

Существенным недостатком известных штаммов-продуцентов д;амилазы и продуцентов протеазы, в том числе и штаммов, принятых в качестве базовых образцов, является их чувствительность к производственным фагам.

В тех случаях, когда фаговый фон на производстве повышается, не исключены операции, сопровождающиеся лизисом культуры.

Цель изобретения — получение штамма-продуцента *-амилазы и протеазы, обладающего широким спектром фагоустойчивости по отношению к специфическим фагам, встречающимся в производственных условиях, и не уступающего лучшим известным штаммам по основным производственным показателям: уровню ферментативной активности и скорости роста.

Новый штамм Bac.subtilis ФУ-79, являющийся предметом предлагаемого изобретения, получен в результате селекции на фагоустойчивость к ряду выделенных образцов фагов среди потомства колоний, развившихся после

15 посева на газон фагочувствительного штамма Вас.subtilis 103, фаголизата из производственного ферментефа, засеянного культурой штамма Вас.subtl11s У-43.

20 Таким образом, исходным для получения предлагаемого продуцента

d;амилазы и протеазы штамма Bac.subtl1is ФУ-79, является штамм Bac.subtl1is 103. Йа производстве штамм

25 103 используется, как продуцент амилолитических и протеолитических ферментов. Предлагаемый штамм Вас111us

subti1ls ФУ-79 в зависимости от условий культивирования может проду30 .цировать cL-амилазу или протеаэу.

885253

Штамм Bacillus subtilis Фу-79продуцент k-амилазы и протеазы хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный М ЦМПМ В-1989.

Биологическая характеристика штамма ФУ-79.

Культурально-морфологические приз- 0 наки штамма Вас.ьиЬй111э ФУ-79, Морфология. Клетки штамма представляют собой грамположительные, спорообразующие палочки размером 1,73,0 0,4-0,7 мк..Размер спор;1,0-1,2х

Х0,5-0,7 мк. 15

Мясо-пептонный агар (МПА) .Через

48 ч роста при 37 С íà МПА культура образует беловатые; выпуклые, морщинистые колонии диаметром 2,5-4 мм.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) . При 20 выращивании в МПБ через 24 ч при

37 С без встряхивания на поверхности образуется морщинистая пленка. Рост беэ помутнения среды. При встряхивании на качалке среда мутнеет. При стоянии образуется пленка.

Агариэованная среда Хоттингера.

При выращивании в течение 24 ч при

37 С культура образует желтовато-серые круглые, выпуклые, морщинистые колонии с лопастным краем диаметром

3,5-4,5 мм.

На синтетической среде с минеральным азотом (среда Спецайзена) .

Культура растет в виде мелких, круглых колоний диаметром 1-2 мм сероватобелого цвета, На ломтиках картофеля культура образует морщинистую, складчатую пленку серовато-белого цвета. Со временем пленка ослизняется. 40

Желатину разжижает. Крахмал гидролизует.Молоко пептонизирует.

Отношение к источникам углерода.

Глюкозу, лактозу, фруктоэу,сахароэу усваивает. 45

Хранение штамма производят в лиофильно высушенном состоянии в стеклянных ампулах.

Предлагаемый штамм Вас.subtilis

ФУ-79-продуцент -амилазы и протеазы отличается широким спектром фагоустойчивости.

Штамм ФУ-79 стабильно сохраняет ! признаки фагоустойчивости, что было многократно проверено в ряде пересевов. В процессе роста он не отщепляет фагочувствительных клонов и не вытесняется фагочувствительным штаммом (например, У-43) в смешанной культуре. Помимо устойчивости к производственным фагам штамм Bac.sub" 60

tilis ФУ-79 характеризуется тем,что достигает высокого уровня активности ci-àìèëàçû за более короткий срок ферментации (240 ед/мл эа 44 ч), в то время как .штамм Вас.subtilis, 65

АС ед/мл

ПС, ед/мл

Опыт Штамм

1 ФУ-79

357

14,7

103

210

6,8

У-43

315

9,6

2 ФУ-79

364

13,8

103

207

6,4

У-4 3

333

3 ФУ- 79

342

14,2

103

221

6,3

У-43

ФУ-79

308

10,2

14,2.

354,3

212, 7

318, 7

Средняя активность по 3 опытам

103

6,5

9,3

В-44, принятый в качестве базового образца (304 ед/мл за 62 ч), а также более высокой активностью протеаэы по сравнению со штаммом Bac.subti11s-5О.

Для проверки ферментативной активности предлагаемого штамма ФУ-79 проводят опыты по глубинному культивированию его в качалочных колбах объемом 750 мл, содержащими 50 мп питательной среды. Для биосинтеэа

*-амилазы штамм выращивают на среде следующего состава, Ъ: крахмал осахаренный 10, СаСО 0,03; лактоэа

0,3 KgS04. О 3; MgS04 О 015; NaC1

О, 03; СUSO< О, 00039; (NH4)g НР04 О, 84, кукурузный экстракт 1, 2, BBK 0,24; вода водопроводная (рН до стерилизации 7) 2. Число оборотов качалки

180 об/мин. Выращивание осуществляют при 37 С в течение 46 ч. Амилолитическую активность в культуральной жидкости определяют по методу БЕРа.

Для биосинтеза используют среду состава, Ъ::-<рахмал осахаренный 8, CaCOB Ой; NgS04. 005; КС1 015;

CaCl1 О,О1; (NH4)g HPOg 1,2, кУкурузный экстракт 0,8, БВК 0,4 (рН до стерилизации 7) 4. Число оборотов качалки 220 об/мин. Выращивание осуществляют при 37 С в течение 44 ч.

Протеолитическую активность определяют модифицированным методом Ансона (ГОСТ 20264.2-74) . Параллельно в этих же условиях выращивают штаммы

Вас. sub t i l i s-103 43.

Амилолитическая (АС) и протеолитическая (ПС) активности. штаммов Вас.

subti1is ФУ-79,103 и У-43 приведены в таблице.

885253

Формула изобретения

Составитель Т.Тулякова

Редактор M.Ëûcîãîðîâà Техред Е.Харитончик Корректор M.ÊîñTà

Заказ 10446/33 Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4

Из таблицы видно, что амилолитическая активность предлагаемого штамма ФУ-79 превышает активность штам-, мов 03 и У-43 на 66,6 и 11,2Ъ, а протеолитическая активность на 118,5 и 52,7Ъ соответственно.

Использование штамма Bac.subtilis

ФУ-79 для получения at-àìèëàçû и протеазы в производственных условиях.

Пример 1, Посевной материал получают выращиванием штамма Bac.sub tilis ФУ-79 в колбах в виде пленки в жидкой питательной среде состава,Ъ: крахмал 10; аммоний лимоннокислый

2-х замещенный 3; КН РО40,2;NagHPOq

0,03; MgS04 ° 7Н10 0,15; Са504. 0,14;

FeSO4, 0,002; MnSO 0,000125; Сы504

0,00075; н -аминобензойная кислота

0,001; 86,2; рН 6,0-6,3. Температура 37оС Полученным посевным материалом, составляющим 0,01Ъ объема среды в ферментере, засевают аппарат объемом 20 м с 10 м ферментацион3 ной среды следующего состава, 1

Я. крахмал осахаренный 22,5 (10Ъ вносится сразу, остальное в виде подпитки);

СаСО О, 03; Na C1 О, 03: KgS04 О, 3;

Мд 504.0, 015; CuS04.0, 00039; БВК О, 24 (NH4) HPO@0,84> кукурузный экстракт

1,2;пропинол (пеногаситель) 0,05, Ферментацию ведут при 37 С с аэрацией в течение 44 ч. Культуральную жидкость с амилолитической активностью 240 ед/мл (колориметрический метод ГОСТ 20264.4-74) высушивают на распылительной сушилке. Выход готоного продукта равен 72Ъ.

Пример 2. Штамм-продуцент и среда для приготовления посевного материала те же, что и в примере 1.

Культивирование проводят в ферментере объемом 20 м с 10 . л ферментационной..среды,Ъ: крахмал осахаренный 13; СаСО3 0,05; КС1 О, 15;CaC1g

О, 01; MgSO<0, 05; (NH g)g MPH 1, 2; кукурузный экстракт 0,8; пеногаситель пропинол 0,05; рН 6,6.

Процесс ферментации идет при 37 С с аэрацией в течение 38 ч. Культуральную жидкость, имеющую aKTHBHOGTb протеазы, равную 30 ед/мл, определенную по модифицированному методу Лисона (ГОСТ 20265.2-74), высушивают на распылительной сушилке.. Выход сухого продукта 60Ъ.

Таким образом, предлагаемый штамм .Bac,subti1is ФУ-78 может быть использован как продуцент at.-амилаэы от исходного штамма Bac.subtilis 103 и других известных штаммов.-продуцентов at-амилазы и продуцентов протеазы широким спектром устойчивости к фагам, распространенным на Вышеволоцком заводе, ряду фагов, выделенных на других ферментных заводах, ряду лабораторных штаммов фагов, специфичных для Bac.subtilis.

Использование фагоустойчивости

20 штамма Фу-79 позволит обеспечить более стабильное производство ферментных препаратов. Кроме того, по срав- нению с другими продуцентами, штамм

Вac.suotilis Фу-79 обладает более

25 высокими уровнями активности -амилазы и протеазы.

Штамм Bacillus subtilis ФУ-79-продуцент d. — àìèëàçû и протеазы. Штамм хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный но зр ЦМПМ В-1989.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

40 1. авторское свидетельство СССР по заявке 9 2711504/13, кл. С 12 D 13/10, 1979.

2. К1ау 1 ., Moser P.l4. Biochem.

Biophys Res Commun ч.34, р.600-604,.

45 1969 °