Способ разделения белков
Иллюстрации
Реферат
Союз Советских
Социалистических
Реслублик
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 06.05.80 (21) 2954356/30-15 с присоединением заявки №вЂ” (51) М. Кл.
G 01 N 27/26
G 01 N 33/48
Гееудеретееииый кемитет (23) Приоритет
СССР йо Аелем изебретеиий и етермтий
Опубликовано 07.12.81. Бюллетень № 45 (53) УДК 54-45:
:541. 132.4 (088.8) Дата опубликования описания 17.12.81 (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
Изобретение относится к медицинской и биологической химии, в частности к разделению высокомолекулярных амфолитов, например белков.
Известен способ разделения белков путем создания боратно-полиольного градиента рН за счет формирования градиента концентрации полигидроксильных соединений в боратном буфере 11).
Полигидроксильное соединение и концентрацию борно-боратного буфера выбирают произвольно (обычно работают с буферами концентрации 0,001 вЂ,01 М).
В зависимости от области рН, в которой собираются проводить разделение белков, выбирают рН буфера и диапазон концентраций полигидроксильного соединения, формируют градиент рН желаемой формы, создавая соответствующий градиент концентрации полигидроксильного соединения, после чего проводят в нем разделение белков. Таким образом, эти градиенты рН создаются произвольно, однако во всех случаях концентрация борно-боратного буфера вдоль градиента рН задается постоянной.
Недостатком способа является то, что такие градиенты нестабильны и изменяются в процессе изоэлектрического фокусирования. Для градиентов рН, формируемых с помощью данного полигидроксильного соединения, это проявляется тем сильнее, чем более щелочную область перекрывает градиент. При этом качество разделения белков ухудшается с увеличением нестабильности. Поэтому использование известного метода ограничено, в основном, разделением кислых и слабокислых белков.
Целью изобретения является улучшение качества разделения белков.
Это достигается тем, что одновременно с формированием градиента концентрации полигидроксильных соединений создают гра1 диент концентрации боратного буфера.
Пример. Выбирают поли гидроксильное соединение и исследуют зависимость рН боратного буфера от концентрации этого соединения. Определяют область рН, в которой находятся изоэлектрические точки
20 разделяемых белков. По данной зависимости находят концентрацию полигидроксильного соединения, обеспечивающую получение в боратном буфере рН, равного значе888022
3 нию рН кислой границы области разделения белков. Готовят раствор, содержащий боратный буфер и полигидроксильное соединение в данной концентрации. Этот раствор используют для создания градиента и в качестве анодного буфера. При формировании градиента рН его смешивают с растворителем, создавая тем самым градиент концентрации полигидроксильного соединения и одновременно градиент концентрации буфера, так что соотношение этих концентраций вдоль градиента рН исходно задается постоянным. Пропорции смешивания определяют из зависимости рН боратного буфера от концентрации полигидроксильного соединения. При смешивании происходит уменьшение концентрации боратного буфера и соответственно его буферной емкости, так что он в итоге может потерять свои буферные свойства. Поэтому степень разбавления буфера ограничена, как следствие этого ограничен диапазон концентрации полигидроксильного соединения в нем и, следовательно, диапазон рН. Способ позволяет получить градиенты рН диапазоном до 1 ед. рН в интервале рН 3 — 10.
В том случае, когда в градиент рН требуется внести какое-либо вещество в постоянной концентрации (например, соль для увеличения ионной силы), его вводят в этой концентрации как в анодный буфер, так и в растворитель при смешивании градиента.
Разделение белков в сформированном градиенте с последующим отбором проб проводят аналогично общепринятым методикам.
Для формирования градиентов рН в боратном буфере выбрали маннит, который при известном способе дает в щелочной области нестабильные градиенты рН, так что разделение белков в них затруднительно. В качестве объекта разделения использовали промышленный препарат гемоглобина крупного рогатого скота. Гемоглобин имеет изоэлектрические точки в слабощелочной области. Разделение проводили в вертикальной электрофоретической колонке размерами 2,5х40 см стабилизированной против конвекции градиентом плотности сахарозы.
Приготавливают следующие растворы.
1. 0,2 М борно-боратный буфер, рН вЂ” 9,25.
При этом значении рН обладает буферной емкостью, близкой к максимальной. Раствор использовали для приготовления
5x10Ъ борно-боратного буфепа.
2. Анодный буфер: 1, 1 х10 М Д-маннит, с 5х10 М борно-боратным буфером в контрольных опытах по разделению гемоглобина в градиенте рН без такой стабилизации.
3. Катодный буфер: анодный буфер, разведенный в 4 раза дистиллированной водой в опытах со стабилизированными градиен4 тами, 5xlO И борно-боратным буфером— в контрольных опытах.
4. Гемоглобин, 1 мг/мл: 5 мг промышленного препарата лиофилизированного гемоглобина крупного скота растворяли в 5 мл дистиллированной воды при разделении в стабилизированном градиенте, 5х10 М борно-боратного буфера — в контрольных опытах.
Раствор использовали для внесения белка в колонку при формировании градиента.
Все вещества для приготовления растворов использовали без дополнительной очистки, растворы готовили на дистиллированной воде.
Линейный градиент рН в интервале
7,4 — 8,2 формировали с помощью градиентного смесителя в колонке между 12 — 35 см, считая от ее верха. Ниже колонку заполняли анодным буфером, выше раствором, соответствующим по составу верхнему концу градиента. Раствор гемоглобина при формировании градиента вносили в колонку так, что он визуально определялся между 17 и 19 см от верха колонки. Во всех экспериментах пропорции смешивания растворов при создании градиента и заполнение колонки были идентичными.
Разделение проводили 7 ч при падении напряжения 30 в/см и охлаждении (температура на выходе охлаждающей системы колонки 1 — 1,5 С) .
При разделении промышленного препа30 рата гемоглобина крупного рогатого скота в градиенте рН, формируемом предлагаемым способом, градиенты рН до опыта и после практически не различаются между
-собой, получено 6 фракций белка. Градиент рН, созданный известным способом, существенно изменяется в течение опыта, препарат разделяется на 2 фракции.
Способ разделения белков в стабилизированных боратно-полиольных градиентах рН предлагается для использования при
4О получении высокочистых белковых препаратов в научно-исследовательской практике и промышленности.
Формула изобретения
Способ разделения белков путем созда45 ния боратно-полиольного градиента рН за счет формирования градиента концентрации полигидроксильных соединений в боратном буфере, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества разделения белков, одновременно с формированием градиента
5О концентрации полигидроксильных соединений создают градиент концентрации боратного буфера.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Ажицкий Г. Ю. и др. Степень микроЫ гетерогенности сывороточного альбумина человека и изучение способности его отдельных фракций связывать гемин, Биохимия, т. 41, вып. 4, 1976, с. 597 — 603.