Способ получения митогенного фактора

Способ получения митогенного фактора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Оп ИСАЙКЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советск их

Социалистические

Республик (»)889001 (6I ) Дополнительное к авт. свнд-ву(22) Заявлено 03. 01. 80 (21) 2908897=28-13 с присоединением заявки J% (23)Приоритет (5l)M. Кл.

А 61 К 35/26

9и)ааретеева» кеевтет

СССР ао делэи азабретений и вткрытнй

Опубликовано 15.12.81. Бюллетень Юя 46 (53) УДК 61 .771.7(088.8) Дата опубликования описания 18. 12.81 (72) Авторы изобретеиия (7I) Заявитель

Белорусский научно-исследовательский крови

{54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИТОГЕННОГО ФАКТОРА

Изобретение относится к медицине а именно к способам получения препаратов, стимулирующих иммунитет.

Известен способ получения митогенного фактора путем инкубации культуры лимфоцитов человека с фитогемагглютинином с последующим отмыванием и культивированием лимфоцитов в.питательной среде 11.

Однако известный способ не обеспечивает стабильного получения мито-. то генного фактора с .достаточно высокой активностью, что не позволяет созда" вать на их основе. метод получения.митогенного фактора.

Целью изобретения является повы15 шение активности целевого продукта.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа получения митогенного фактора путей инкубации культуры лимфоцитов человека с фитогемагглютинином (ФГА) с последую,щим отмыванием и культивированипм лимфоцитов в питательной среде, отмытые лимфоциты культивируют при 3940в

Способ осуществляют следующим образом.

Лимфоциты человека выделяют из гепаринизированной крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколлгипаг, отмывают и ресуспендируют в концентрации 3-4 млн/мл в бессывороточной среде Игла. Клети инкубируют 40 мин с Фитогемагглютинином (ФГА) и культивируют в течение 48 ч при 40 С в бессывороточной питательной среде. Затем клетки осаждают центрифугированием и удаляют, а бесклеточную культуральную среду, содержащую митогенный фактор, собирают и стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры, сохраняют при 20 С.

Пример. Лимфоциты выделяют из свежей донорской крови, стабилизированной гепарином, путем центриФугирования в градиенте плотности

Фиколл-гипаг (плотность 1,077 г/см ), Э

8890 дважды отмывают средой 199. Клетки доводят до концентрации 3,7 млн/мл в среде 199 и инкубируют с ФГА-Р

{в концентрации 30 мкг/мл) при 37 С в течение 40 мин, Затем лимфоциты от5 мывают от ФГА, не связывающегося с клетками, и культивируют в бессывороточной питательной среде Игла, содержащей глютамин — 100 мкг/;.л, пенициллин — 100 ЕД/мл и стрептомицин — 100 мкг/мл в течение 48 ч в о термостате при 40 С в атмосфере увлажненного воздуха с 5i-ной gp+. В конце культивирования клетки удаляют иэ среды центрифугированием при 15

1000 об/мин, а культуральную среду, содержащую митогенный фактор, отсасывают и фильтруют через стерилизующие миллипоровые фильтры (размер пор 0,3 мкм). Иитогенная активность культуральных сред исследуется в тест-культурах свежевыделенных лимфоцитов здоровых доноров. Для этого смешивают 1 объем исследуемой на активность культуральной среды в 3 синтез ДНК (имп/мин) в тест-культу синтез ДНК имп мин в контрольных фактора

Сравнительные результаты, полученные предложенным способом и известным способом, представлены в таблице

Количество

Температура культивирования Активность митогенного

ФГА-стимулированных лимфа- фактора (выраженная в цитов индексах стимуляции) живых клеток в культуре, млн/мл

37 (известный способ)

40 (предложенный способ) о

2,67

3,18 0,33 п=4

19,9+2,52 п=4

2. 50

0,82

3,2741,22

Как видно из таблицы культивирование стимулированных ФГА лимфоцитов в соответствии с предложенным способом при 40 С приводит к увеличению о активностй получаемого митогенного

Фактора в 6,25 раза по сравнению с активностью фактора, полученного известным способом. Данные таблицы также обосновывают предел повышения температуры культивирования, так как культивирование при 42 С не вызывает о увеличения продукции митогенного фактора и приводит к гибели большей части клеток.

01

4 объема свежей питательной среды Игла с 103 термоинактивированной аутосыворотки в присутствии глютамина и антибиотиков в указанной концентрации. Конечная концентрация лимфоцитов в тест-культурах — 0,6 млн/мл.

Для инактивации остатков ФГА в исследуемые культуральные среды прибавляют 63 кроличьей антисыворотки против ФГА. Синтез ДНК в тест-культурах исследуют по включении 3Н-тимидина, радиоактивность клеток измеряют на спектрометре ПАКАРД 2450. Активность митогенного фактора выражают индексом стимуляции, который представляет собой отношение величины синтеза ДНК в тест-культурах в присутствии фактора к величине синтеза ДНК s контрольных тест-культурах, не содержащих митогенного фактора, но содержащих ФГА в концетрации 7,5 мкг/мл и 63 антисыворотки против ФГА (контроль на нейтрализацию ФГА). Таким образом> индекс стимуляции (ИС) равчяется рах с митогенным фактором тест-культурах без митогенного

Способ применен < и< пользованем

-крови различных доноров (5 человек).

В результате установлено, что кульо тивирование лимфоцитов при 40 С приводит к стимуляции выделения фактора в 1003 случаев, средний коэффициент усиления продукции равен

9,16. При использовании в качестве желаемой активности фактора индекса стимуляции 4 видно, что по известному способу фактор с желаемой

40 активностью получен в 2 случаях иэ 5 (403), а по предложенному способу в

1003 случаев. Таким образом, предложенный способ позволяет повысить активность целевого продукта при уменьшении затрат крови доноров, идущей

45 для получения митогенного фактора.

889001

Формула изобретения

Составитель 10. Алмазов

Редактор Л. Плисак Техред Е.Харитончик

Корректор С. Щомак

Тираж 690 Подписное

ВНИИПИ. Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035„ Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 10801/9

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения митогенного фактора путем инкубации культуры лимфоцитов человека с фитогемагглютинином с последующим отмыванием и культивированием лимфоцитов в питательной среде, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, отмытые лимфоциты культивируют при 39-40 С.

Источники информации

Э принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР по заявке N 2628368/28-13, кл. А 61 К 35/36, 1978.