Способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки
Патент 889003
Авторы
Классы МПК
Способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки
Иллюстрации
Реферат
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик
< >889003 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)заявлено 01.06.79 (21) 2773922/28-13 с присоединением заявки РЙ (23) П риоритет (5!)М. Кл.
А 61 K 39/395
9Ьаударатаеииый квинтет
СССР
Опубликовано 15. 12.81. Бюллетень Рй 46
Дата опубликования описания 18. 12.81 иа делаи изабретеиий и открытий (53) УДК 615 . 373. 34 (088.8) г.. (.к..:, /
/ задзиева--!, .1 !, г
К
4"
""%Ви (72) Авторы изобретения
В.Е. Сидорова, В.В. Колесникова и /1 Ф.
i, ë
Владивостокский научно-исследовать эпидемиологии и микробиологии (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ
ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ СЫВОРОТКИ
Изобретение относится к микробиологии и касается получения диагностических препаратов.
Известен способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки путем выращивания псевдотуберкулезных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животныхпродуцентов:, и отделением сыворотки крови (1J.
Однако известный способ не обеспечивает получения сыворотки с высокой специфичностью.
Целью изобретения является повышение специфичности сыворотки.
Эта цель достигается тем, что спо° соб получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки осуществляют ,путем выращивания псевдотуберкулез. ных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животныхпродуцентов и отделением сыворотки крови, псевдотуберкулеэный микроб . выращивают при 10-12 С, выделяют спе0 цифический поверхностный антиген и иммунизацию проводят однократно в дозе 0,1-0,15 мл с содержанием белка
100 мкг/мл физиологического раствора.
Согласно предлагаемому способу получения псевдотуберкулезных сывороток для иммунизации используют высокоспецифический поверхностный антиген, полученный иэ микробной клетки ! а,-
,Ч. pseudotuberculosis без нарушения
его природной структуры. Выделенный комплекс является сильным антигенным раздражителем, способным даже при однократной иммунизации вызывать ruI5 периммунный ответ макроорганизма.
Для иммунизации кроликов выделяют поверхностную субстанцию псевдотуберкулезного микроба наиболее щадящим
20 способом — механической дезинтегра" цией, что обеспечивает сохранение вещества в нативной форме. Далее из поверхностной субстанции осаждают высокомолекулярную фракцию центрифу3 88900 гированием при 35000 q. Эту фракцию затем перерастворяют в небольшом. объеме низкомолекулярной фракции (супернатанте). Иммунизация кроликов смесью этих фракций с превалировани5 ем высокомолекулярного компонента
3 обеспечивает острый иммунный ответ животных.
Для иммунизации кроликов исполь" зуют антиген s низких концентрациях по белку (10-15 мкг) для одноразового внутривенного введения вещества.
Антиген, взятый в дозе менее 10 мкг, гуморального ответа не вызывает..Использование же антигена в дозе, превышающей 15 мкг, вызывает иммунологический паралич. Для получения специфических диагностических псевдотуберкулезных сывороток оптимальной дозой вводимого препарата является
i0-15 мкг в 0;1 мл физиологического раствора.
Пример. Материалом для иммунизации кроликов служит комплекс поверхностных антигенов псевдотуберкулезного микроба. Чтобы получить его культуру микроба выращивают в течение 2-3 суток на мясо-пептонном агао ре при 10-12 С, что позволяет сохранить микроорганизмы в S-форме (в стабильном состоянии). Затем культуру смывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7,2-7,4),центрифугируют при 5500-6000 g об/мин в течение 30 мин и двукратно отмывают этим же раствором, центрифуги35 руют культуру по 30 мин. Надосадочную жидкость удаляют. Осадок ресуспенди IO руют до концентрации 2.10 в физиологическом растворе с фосфатным буфе49 ром (рН 7,2-7,4), а поверхностный антиген отделяют на механическом дезинтеграторе в течение 15 мин, дающий 3000 колебаний в минуту. После отделения поверхностной субстанции
4$ бактерии осаждают центрифугированием при 6000 об/мин в течение 30 мин и удаляют. Суспернатант консервируют мертиолатом натрия (1:5000-1:10000, экспозиция 1 ч при 4 С) и вновь цент рифугируют при 9000 об/мин (для уда56 ления единичных бактерий). Осадок удаляют, а супернатант центрифугируют при 37000 q в течение 2-х часов при 4 С. Полученный осадок (высокомолекулярную фракцию поверхностного
И антигена) перерастворяют в минимальном количестве (1/5 часть) суспернанта (низкомолекулярная фракция), 3 4 определяют количество белка по Лоури и разводят до концентрации 100 мкг белка в 1 мл физиологическим раствором.
Схема иммунизации животных. Кроликов весом 2,5-3 кг однократно иммунизируот внутривенно в краевую ушную вену в дозе 0,1 мл (10-15 мкг белка) препарата, растворенного в
0,1 мл физиологического раствора.
Через 8 дней проводят пробное взятие крови и определяют титр гемагглютининов. Б зависимости от индивидуальной чувствительности животных титры антител колеблются в пределах
1/6400-1/51300. Для иммунизации животных используют антиген, приготовленный согласно предлагаемому способу, который разводят физиологическим раствором до концентрации 100 мкг белка, определенного методом Лоури.
После установления титра антител животных обескровливают, отделяют сыворотку, лиофильно сушат и хранят в холодильнике при 4 C. Срок хранео ния (срок наблюдения) более года.
Специфичность сывороток проверили в реакции непрямой гемагглютинации с чумным антигенным диагностикумом и в реакции агглютинации с живыми культурами S. enter!tidi5, S. paratypЕ, Е. coli 0-124, с вакцинным штаммом чумного микроба (EV) и диагностикумом брюшного тифа.
Сыворотки, приготовленные по известному способу, давали положительные РНГА и РА с чумным эритроцитарным антигенным диагностикумом и вакцинным штаммом чумного микроба (Е>/) в разведении 1:50. Сыворотки,приготовленные предложенным способом, имеют положительные РНГА и PA с указанными диагностикумами в разведениях I:40 и 1:20 соответственно. С остальными культурами реакции оказались отрицательными.
Полученные диагностические превдотуберкулезные сыворотки обладают до; статочной чувствительностью, высокой специфичностью, имеют высокую концентрацию антител и найдут широкое применение в баклабораториях санэпид" станций с целью диагностики псевдотуберкулеза и установления серологической принадлежности возбудителя заболевания. Сроки получения этих сывороток в 2 раза короче известного ранее способа, что экономически более выгодно.
Формула изобретения
88900
Составитель С. Малютина
Редактор Л. Плисак Техред С.Мигунова Корректор А. ФеРенц
Тираж б90 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, E(-35, Раушская наб., д. 4/5
Заказ 10801/9
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Способ получения диагностической псевдотуберкулезной сыворотки путем выращивания псевдотуберкулезных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животных-продуцентов и отделением сыворотки крови, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности сыворотки, псевдотуберкулезный микроб
3 .I выращивают при 10-12ОС, выделяют специфический поверхностный антиген и иммунизацию проводят однократно в дозе 0,1-0,15 мл с содержанием белка 100 мкг/мл физиологического раствора.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Королюк А.М. Серологическая диагностика псевдотуберкулеза. Канд. дис. Л., 1971.