Октапептид,обладающий способностью специфически ингибировать прессорный эффект и миотропное действие ангиотензина 11

Октапептид,обладающий способностью специфически ингибировать прессорный эффект и миотропное действие ангиотензина 11

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

органического синтеза AH Латвийской ССР (54) ОКТАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИ

ИНГИБИРОВАТЬ ПРЕССОРНЫЙ ЭФФЕКТ И МИОТРОПНОЕ

ДЕЙСТВИЕ АНГИОТЕНЗИНА II

Изобретение относится к синтезу нового соединения-октапептида, обладающего способностью специфически ингибировать прессорный эффект и миотропное действие ангиотензина 1? который может найти применение в меди- цине.

Нарушения в функционировании ренин-ангиотензин-альдостерочовой системы могут являтся причиной развития гипертонической болезни "lj. о

Однако влияние этиологии гипертонии весьма затруднено из-за отсутствия специфических антагонистов ангиотензина 1I.

$$

Применяемые в настоящее время ин" гибиторы ангиотензина 11 представляют собой его парциальные агонисты, сохраняющие высокое средство к специфическим рецепторам ангиотензина g, но с пониженной константной диссоциации К .

Известные ингибиторы ангиотензина II, представляют собой аналоги ангиотензина II, модифицированные главным образом в положениях 1 и 8; Попытки произвести дополнительные мо" дификации в других положениях приводят к резкому снижению антагонистических свойств.

Наиболее исследованным ингибитором ангиотензина II в клинических условиях является (I-саркозин, 8-аланин).-ангиотензин !!(саралазин) lZ3 и(33

Однако применение саралазина для диагностических целей существенно ограничено вследствие его агонистических свойств, что не только не позволяет определить уровень активности ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, но иногда представляет серьезную опасность ввиду сильного и длительного глпертензивного эффекта.

Цель изобретения - расширение ар сенала средств воздействия на живой организм.

891648

Все аминокислоты L-конфигурации.

io

Соединение 1отличается от саралазина и других его структурных аналогов дополнительной модификацией в положении 3 (остаток валина в положении 3 ! заменен на остаток аза- cL -гомовалина), что приводит. к понижению прессорной активности без изменения срод" ства к рецепторам ангиотензина II.

В опытах in vivo u in vitro соединение l не проявляет прессорного эффекта, даже при наивысших применяемых концентрациях соединения 1 .(до 500 мкг/кг). Саралазин же обладает 12Ф-ной прессорной активностью природного гормона.

Таким образом, соединение I имеет существенно улучшенные фармакологические свойства по сравнению с известным ингибитором ангиотензина ll, весьма важные для практического применения 2, в частности для диагностики и терапии рениновых форм гипертонической болезни.

Соединение I, синтезировано конденсацией отдельных фрагментов известными методами М согласно схеме. Промежуточные соединения (2)-(6) и(10) (18) получены также известными способами 1.41. При этом применялись бензилоксикарбонильная, нитро,метиль" ная, трет-бутилоксикарбонилгидразидная, гидразидная, и-нитробензильная группа. трет-Бутилоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил"саркозил-N-нитроаргинил-валина (7) получают карбодиимидным методом,конденсируя бензилоксикарбонил-N-нироаргинин-(5) с трет-бутилоксикарбонилгидразидом валина (6) в присутствии двух моль

1-оксибензотриазола. Защиту гидразидной функции-трет-бутилоксикарбонильную группу соединения (7) -отщеп ляют трифторуксусной кислотой при комнатной температуре. Азид, полученный по методу Рудингера из гидразида

1 (8) выдерживают в растворе диметилформамида при 60 С 1 ч. В таких условиях азид полностью перегруппироаыПоставленная цель достигается октапептидом формулы

Sar-Arg-aza-d -Hva-Tyr-VaI Íis-Pro-3lе

i3 (х) где Sar - остаток саркозина;

aza-d, -Hva=aza- d -гомо-L-валина I

NH-СН-NH-C01

СН(СН )о

35 о

45 о вается а изоцианат (9), который без выделения вводят в реакцию с аминокомпонентом (18). Защитные группы у полученного октапептида (19) удаляют каталитическим гидрогенолизом. Октапептид I очищают ионообменной хроматографией на CM-целлюлозе в градиенте ацетата аммония. Состав и однородность полученного аналога доказаны аминокислотным и элементным анализами на хромато- и электрофореграммах имеется одно пятно с положительной реакцией на нингидрин, реактив Сакагучи

Паули,Рейнделя-Хоппе, Эрлиха, (на уреидную группу).

Исследование биологических свойств соединения 1., Ииотропная активность (1-саркозин, 3-аза- d. -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин) ангиотензина П изучалась в опытах in vitro согласно методике

van Rossum (5) посредством регистрации изотонических сокращений еосходящей ободочной кишки (Colon ascendens) крыс, являющейся наиболее чув" ствительным тест-органом для исследования миотропной активности ангиотензина 11 (6), с использованием модифицированного прибора ВИ6-5МА.

Агонистические и антагонистические свойства изучают в диапазоне концентраций 10" - 1(Г И, время предварительной экспозиции кишки с исследуемым соединением составляет 3 мин.

При вычислении кумулятивных кривых концентрация - эффект (КККЭ) применяют машинную обработку экспериментальных данных (каждая точка опре деляется как средняя из 6 опытов) с определением стандартной ошибки при р=0,05 °

Для количественной характеристики конкурентного антагонизма (1-сарI козин, 3-аза- cL --гомовалин,5-валин, 8-изолейцин) ангиотензина 11 вычисляют параметр рА о.

В опытах in vitro соединение 1 в диапазоне концентраций 10 — 1О И не

-10 проявляет миотропного эффекта, но в концентрациях 10 - 108И вызывает прогрессивное параллельное перемещение КККЭ ангиотензина 11 в сторону высших концентраций, т.е. проявляет конкурентный антагонизм с ангиотензином Il, характеризующийся величиной рА — — 8,60 4 0,29. В концентрации 10 M исследуемое соединение вызывает понижение высоты ККК3 ангио1тензина ll, а в концентрациях 10

5 89

10 И полностью ингибирует миотропный эффект ангиотензина I I (фиг. l ) .

В опытах in vivo регистрируют артериальное давление из общей сонной артерии наркотизированных уретаном белых крыс обоего пола весом 100200 r с помощью ртутного манометра на закопченной ленте кимографа. Вещества вводят в бедренную вену в виде инъекций в объеме 0,1 мл/200 г веса в дозах 0,5-500 мкг/кг.

При изучении антагонизма исследуемого соединения по истечении l мин с момента его введения крысам вводят ангиотензин И в стандартных дозах

0,5; 2,5 и 5 мкг/кг. Вычисляют кривые "доза-эффект" для ангиотензина

II в присутствии и в отсутствии антагониста.

В опытах in vivo исследуемое соединение не обладает прессорной активностью, даже при наивысших применяемых концентрациях (до 500 мкг/кг), но значительно ингибирует прессорное действие ангиотензина 11. В присутствии (l-саркозин,3-аза-* -гомовалин,8-изолейцин)ангиотензина II в дозе 5 мкг/кг требуется 10-ти кратное увеличение дозы ангиотензина ll для достижения его первоначального эффекта (фиг.2)

В синтезе используют аминокислоты

L-ряда. Температуры плавления соединений определяют в открытых капилярах без исправления. Удельные углы оптического вращения измеряют на цифровом поляриметре модели 141 фирмы Рег 1п-Elmer (СПЛ). Электрофорез проводят на бумаге FN-16(Filtrak

ГДР) в 5 н. (рН 1,9) уксусной кислоте при 18 В/см. Электрофоретическая подвижность соединений приведена по отношению к -истидинь (E g„ ) °

ТСХ проводят на пластинках силикагеля фирмы Merck в системах хлороформ-этанол-изопропанол-этилацетатвода 10 б:4:3:1 (Л) н-бутанол-этанол-вода-уксусная кислота 80:10:30:5 (Б); хлороформ-метанол-уксусная кислота 80:10:5 .(В); хлороформ-изопропанол-этилацетат-уксусная кислота" вода 85:5:8:2:0,25 (Д), Вещества на хромато- и электрофореграммах в зависимости от структуры соединения обнаруживает нингидрином и реактивом Паули, а также реактивами Сакагучи, Рейнделя-Хоппе и Бартона. Для элементного анализа вещества высушивают в пистолете Фишера в течение 24 ч над Р 0 5 при 60 С и остаточном давле1640 4

Ю

3Ф

И

3О

35 нии 0,1 мм рт.ст. Кислотный гидролиз пептидов проводят в бн соляной кислоте при 105ц С в запаянных ампулах в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют в автоматическом анализа" торе ВС-200 фирмы Oiocal (ФРГ).

Трет-бутилоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-саркозил-tI5íèò" роаргинил-валина (7), о

К охлажденному до 0 С раствору

6,36 r (l5 ммоль) бензилоксикарбонилсаркозил-й нитроагинина (5), 3,47 r (15 ммоль) трет-бутилоксикарбонилгидразида валина (6) и 4,06 r (30 ммоль)

1-оксибензотриазола в 50 мл ДМФА приливают раствор 3,2 г (16 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 10 мл ДМФА и выдерживают 24 ч при 2 С и 5 ч при

22 С. Дициклогексилмочевину отфильтровызают, фильтрат выливают в 500 мл смеси, содержащей насыщенный раствор

NaCl и 10 -ный раствор КНСО в соотношении 1:1, вещество экстрагируют смесью этилацетат-н-бутанол 1:l,про" мывают насыщенным раствором NaCI, 53-ным раствором КН504, насыщенным раствором NaC 1, высушивают над MgS04, упаривают, и полученное вещество растирают с эфиром. Выход 8,8 (92/); т.пл. 180-105 С, МЯ 22,4 (С 1,ÄMÔÀ);

Ry 0,27(В); Ry 0,78 (Г); Rq 0,47 (Д).

Найдено,З: С 51,45; H 6,79; N 19,67

С Т Н4 и ОВ.

Вычислено,3: С 50,85; Н 6,00; и 19,76.

Гидразид бензилоксикарбонилсаркозил-(Рнитроаргинилвалина (8) .

Раствор 8,7 r (13,64 ммоль) трет-бутилоксикарбонилгидразида (7) в

30 мл трифторуксусной кислоты, вью держивают 20 мин при 22 С и упаривают, остаток растирают эфиром, отфильтровывают и перекристаллизовывают из этанола. Кристаллический осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и эфиром, высушивают в вакууме. Выход б,б г (Oji); т.пл.168170 C;$d-1 0,3 (С 1, ДМФА); Rg 0,20 (Д).

Найдено,3: С 46,87; Н 6,28;

N 21,01.

С11нзбй909

Вычислено,/: С 46,39; Н 6,19; и 22,13.

A -Нитробензиловый эфир бензилокси" карбонилсаркозил-N нитроаргинил-аза- -гомовалил-тирозил-валил-гистидил-пролил-изолейцина (9).

891648

Pro I! е — (эь айаг

Va1

Н (6)

NHN

=О

CJ

С0

СН (СН )д (1)

Схема синтеза (1-саркозин, З-аза- „-гомовалин,5-валин, 8-изолейцин) ангиотензина II

К раствс,". 2,85 г (5 ммоль)(8) в

15 мл дИФА прибавляют 3,3 мл 4,5н раствора HCI в этилацетате реакционную смесь охлаждают до -20 С, прибавляют 0,62 мл (5,5 ммоль) трет-бутилнитрита и выдерживают 20 мин при

-15 С, охлаждают до -40 С, при интенсивном перемешивании небольшими пор" циями прибавляют триэтиламин до рН среды 7,5-8 и упаривают реакционную смесь в вакууме (10 мм рт.ст.), Сухой остаток высушивают 3 ч в глубоком вакууме (10->- 10 ) при температуре бани 20-30 С, потом раствоо ряют в 30 мл сухого этилацетата и выдерживают 1 ч при 60 С (в течение первых 10-15 мин выделяются пузырьки

i азота) . Полученный раствор изоцианата (9) прибавляют к раствору 2,29 r (3 ммоль) дигидробромида и -нитробензилового эфира тирозил-валил-гистидил-пролил-изолейцина и 0,7 мл (6 ммоль) триэтиламина в 15 мл ДИФА, выдерживают 15 ч при комнатной температуре и выливают в 200 мл насыщенного раствора NaC1. Осадок отфильт ровывают, промывают последовательно

54-ным раствором NaHCOg водой, 53-ным раствором KHS0, водой и высушивают на воздухе. Сухое вещество кипятят с 50 мл этанола, отфильтровывают нерастворимую часть, фильтрат упаривают и полученный защищенный октапептид очищают хроматографией на силикагеле в системе хлороформ-этанол-изопропанол-этилацетат-вода 10:6:4:3:1. Выход 2,1 r (543, считая на аминокомЭ понент). T.пл. 180-183 С;fdЦ 21,7 (С 1)ДМФА)1 Rg 0,52(A); R 0,81(6);

Г„,. О,43(рн 1,9) .

Найдено,4: С 55,42; Н 6,33; и 16,91.

1© Cb HPNIb0gb

Вычислено,Ф: С 56,20; Н 6,37;

N 17.47.

Саркозил-аргинил-аза- с -гомовалил-.тирозил-валил-гистидил-пролил-изо1% лейцин 1.

К раствору 1,5 г (1,17 ммоль)(19) в 50 мл смеси метанол-уксусная кислота-вода 6:1:1 прибавляют 1 r палла-. зе диевой черни и гидрируют 12 ч, катализатор отфильтровывают, и фильтрат упаривают. Полученный октапептид 1 очищают ионообменной хроматографией на СИ-целлюлозе. Выход

ЭЗ 0, 1 r (673). Т,пл. 210-213 С; (с Э -54,0ОС (С 0,5, 1н СН СООН);

Rq 0,06 (Г), R 0,04(Б); Eq

Найдено,Ж: С 49,90; Н 7;40; рр Й 16,72.

C@H N@Og 2СН СООН 5H@0

Вычислено,Ж:. С 50,59; Н 7,80;

И 16,86.

Tyr У,l, Hls

891648

Формула изобретения

10

Гиок,lл

10 фиг. 1

ОктагГептид формулы 2 >I 4 Ю 6 т B

Ват — Агс — аы — д.— Hva — Туг-4а Š— н s — Pea-3Ее обладающий способност ьюспецифически ингибировать прессорный эффект и миотропное действие ангиотензина ii, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Laragh J. Н.,Case О, В., Wa11 àcå J.M., Keim Н. Blocade of remin or ang1отепы n for understano»

ling of human hypertension: à ñîmðàгison of propranolol, saralas ï and

converting enzyme biocade. -"Fed.

Ргос." 1977, v. 36, N 5, р. 1781-1787.

2, Wallасе J M. Case О.В., Laragh 3. Н.> Keim Н.J., Drayer 1.1.И.

Sealey J. E. Ihe immediate pressor

responce to saralasin in man. А test

of angiotensin ii receptor Vacancy."Circ. Res", 1979, v.44, и 1, р.38-44. l

3. Keim H.J., Drayer J.1., Case 0.8., Lopez-Ovejегоh J,, Wal lace J.И., Weber М.A., Laragh J.Í. А role for

renin in rebound hypertension and

iЭ encepholopathy after infusion of saralasin acetate(sar-ala -angiotensin l!), N„Engl. J.Не4.", 1976, v. 295, и 21, р. 1175-1177.

4. Химия полипептидов. Под ред. 1 П. Кацоянниса, Пер. с англ. И.,"Мир", 1977.

5. Van Rossum J.È..Cumulative dose-response curves. 1!. Technique

for the. ma King of doseresponce curМ ves in isolated organs and the ечаiu"

ation in isolated organs and the evaluation of drug parameters. - "АгсЬ.

int. Pharmacodyn"., 1963, ч. 143, 8 3-4, р. 299-33О.

6. Regoli О., Vane3.R. А зепз1 tive method for the assay of ang iotensin. - "Brit" J. Pharmacoi.", :1964, v. 23, и 2, р. 351-359., 891648,у wxt )кг

2,f

Составитель Г. Желтухина

Техред М. Надь Корректор М. Демчик

Редактор P. Цицика филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ 11141/33 Тираж 446 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Н-35, Раушская.наб., д . 4/5