Способ получения ферментных электродов чувствительных к метаболитам
Патент 891774
Авторы
Способ получения ферментных электродов чувствительных к метаболитам
Иллюстрации
Реферат
Союз Советскмк
Соцмапмстмческмк
Республик
«и 89 l
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ8У (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 2QI 279 (2 ) 28 56250/ 23-04 с присоединением заявки М (28) Приоритет (ьб)М. Кл.
С 12 и 9/02
С 25 В 11/12 тоеударстескиый комитет
Опубликовано 23,l?81 тзюллетень М 47
Дата опубликования описания 23.1 281 во делам изооретеиий и открытий (53) УДК 542.8а
577.15.07 (088. 8) Ю. 10. Кулис, В. -С.A. Лауринавичюс, А. А. лина ускас, N. В.Песлякене, А.С.Самалюс и Г.-Ю.С.111внрмитткас
I
I
Институт биохимии АН Литовской ССР (72) Авторы изобретения (7!) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРИЕНТНЬЕ ЭЛЕКТРОДОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К METASOJIHTAM
Изобретение относится к энзимоло- гии, конкретно к получению ферментных электродов, и может быть использовано в целях анализа, синтеза электрохимическим способом органических соединений или в биотопливных элементах.
Известны способы получения биоэлектродов, в которых осуществляется
10 прямой обмен электронов между активным центром белков и электродами.
Например, цитохром С, адсорбирован" ный на ртути, платине или золоте, может восстанавливаться электрохимит5 ческим путем f I).
Однако данные системы ие содержат биокатализаторов и не могут быть использованы для получения фермент.ного электрода.
Известен способ получения лаккаэ" ного электрода, восстанавливающего кислород, путем адсорбции фермента на углеродистых материалах (21.
Недостатком данного способа является то, что он не применим для полу" чения ферментных электродов на основе других ферментов, катализнрую" щих превращение продуктов метаболиз- . ма живого организма.
Практически важными являются ферментные электроды, чувствительные к метаболитам - глюкозе, лактату, перекиси водорода, мочевой кислоте, аминокислотам, ксантину, холестернну и др. веществам. Используя такие . электроды создают безреагентные методы анализа и полностью безреагентные электроды, пригодные для анализа метаболитов in vivo, системы элект" росинтеза соединений, в частности аминокислот, а также биотопливные элементы, которые служат в качестве имплантируемых в органиэме датчиков и источников тока.
Однако адсорбция ферментов, каталиэируницих превращение перечисленных метаболитов на углеродистых материа891774 лах, не обеспечивает создание ферментных электродов, вследствие чегз перенос электронов с активных центров флавии- и гем- и металлсодержащих (за исключением Со-содержащих) ферментов на углеродные электроды не протекает.
Известны способы получения ферментных электродов, чувствительных к метаболитам, на основе глюкозооксидазы лактатдегидрогеназы, оксидазы L- u
О-аминокислот, уреазы и др., сущность которых сводится к иммобилизации фермента в геле, нанесению геля на электрод и снабжению его диализной пленкой для предотвращения диффузии фермента в раствор 1 3 ).
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения ферментного электрода на основе глюкозооксида-, зы, заключающийся в том, что фермент, .иммобилизованный в геле, наносят .на платиновый электрод и покрывают иализной (целлофановой) пленкой
4) и f5);
Недостатком известных способов является сложность технологии получения ферментных электродов, а также то, что в аналитических реакциях определения метаболитов, полученные таким способом, ферментные электроды могут использоваться только при наличии особых веществ-медиаторов, служащих для переноса электронов с активного центра фермента на проводник — P1. электрод, Таким образом, генерация тока в системе и работа электрода возможны лишь в присутствии медиаторов, в качестве таковых обычно используются бензохипон, феррицианид или кислород. Поскольку два первых являются ядовитыми веществами, то работа с электродами данного типа требует использования опасных для жизни веществ и, кроме того, невозможна в анаэробнои среде.
Цель изобретения — упрощение процесса получения и улучшение свойств ферментных электродов, Указанная цель достигается способом получения ферментных электродов, заключающимся в том, что фермент адсорбируют на органическом электроде, представляющем собой комплекс органических катионов — метилированньгх производных феназина, акридина, хинолина, пиридина, дипиридина и анион-радикала 7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана, н процесс проводят в растворе при концентрации фермента
10 — 0 моль/л, температуре 4-25ОС и рН 7,0-7,2 в течение 0,5-15 ч.
В кач ес тв е фермен тов ис поль з уют ! гем-.> флавин- и металлсодержащие ферменты: глюкозооксидазу, пероксидазу, 1 лактатдегидрогеназу, оксидазу 0- и
L-< -аминокислот, ксантиноксидазу, диафоразу, уриказу и холестеринокси10 дазу.
Электролиз проводится в интервале потенциалов от О,б до 0,05 В (относительно насыщенного серебряного электрода). Это обеспечивает возможность создания новых ферментных электродов с использованием гем-, металл- и флавинсодержащих ферментов. Используемые органические комплексы обладают не полупроводниковой, а металлической электропроводностью.
Предлагаемый способ позволяет ! изготовить электроды, генерирующие
ТоК в присутствии глюкозы, лактата,, аминокислот, мочевой кислоты и др. г.
25 метаболитов и обладающие селектив.ностью только к этим веществам.
На чертеже показана схема ферментного электрода.
Схема содержит органический металл 1 с адсорбированным ферментом, тефлоновый корпус 2, медная (А) или платиновая (Б) проволока 3, эпоксид ный компаунд 4, эвтектический припой 5, платиновый, титановый или стеклоуглеродный токоотводящий электрод
35 б, диализная мембрана 7, резиновое кольцо 8, Способ осуществляют следующим образом.
0,1 r соли метилированного произQQ водного одного иэ указанных ароматических соединений растворяют в 520 мл горячего абсолютного этилового спирта и к нему добавляют горячий раствор 0,1 г (0,05 М) литиевой соли анионрадикала 7,7,8,8-тетрациан-п. -хинодиметана в 10 мл этилового спирта. Выпавший осадок промывают эфир ром и высушивают в вакуум-эксикаторе.
Полученные порошки черного цвета прессуют под давлением 10 т. К полученным таблеткам ф 2 мм, толщиной 0,5-1 мм припаивают токоотводящий электрод и монтируют их в тефлоновый корпус таким образом, чтобы с электролитом .контактировал только органический проводник (чертеж, А). Подготовленный электрод погружают в раствор высокоочищенного фермента, кан5 центрация которого 10 -10 моль/л (0,004-1,5 мг/мл) в 0,1 Г1 фосфатном буфере рН 7,,2 и выдерживают в течение 0,5-15 ч при 15-20 С. После этого электроды промывают тем же 3 буферным раствором (4-20 мл).
При изготовлении других ферментных электродов 1,0-1,2 мг комплекса добавляют в 3-4 моль/л раствора фермента, содержащего О,1 мг белка.
Суспензия захватывается на токоотводящем электрбде, изготовленном из платины, стеклоуглерода или титана, при помощи диализной мембраны (чертеж, Б). Измерение тока электрода проводится в трехэлектродной схеме в анаэробных условиях в том же буфере.
В основе механизма присоединения фермента к органическому комплексу лежит адсорбция белка на гетерогенных поверхностях, обусловленная ионными и ыандервальсовскими силами взаимодействия. Адсорбция фермента на органическом комплексе протекает практически необратимо.
Пример 1. Электрод, изготов-, ленный из 24 мг комплекса N-метилфеназина (ММФ) и анион-радикала
7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана (ТЦХМ), погружают в 2 мл раствора кристаллической глакозооксидазы
Pen.vitale в 0,1 M фосфатном буфере.
Концентрация фермента 10 моль/л .(15 мг/мл). Электрод выдерживают в ЗЗ растворе фермента при комнатной температуре (15-20 С ) в течение 15 ч.
Промывают электрод фосфатным буфером по 20 мл и подключают к полярографу. Определяют стационарный анодный . 0 ток электрода, который устанавливается в течение 1 мин при разных концентрациях глюкозы.
891774 б течение 10 дн непрерывной работы и более.
Таблица 1
0,078
0,078
О, 0,30
0,65
2,0
3,0
0,98
1,30
1,38
4,0
5,0
6,0
1,40
0,60
1,0
0,5
2,0
1,02
3,0
1,55
4,0
5,0
2,5
6,0
2,65
2,76
7,0
8,0
2,84
9,0
2,88
10,0
3,0
11,0
3,16
12,0
3 20
3,28
13,0
Зависимость анодного тока окисле.ния глюкозы адсорбированной на . комплексе ММФ ТЦХМ глюкозооксидазы (pH 7,2 0,1 M o aTHbiH 6 e, 25 C) приведена в табл.1. Электрод сохраняет высокую стабильность во времени.
Зависимость тока глюкозооксидаэ" ного электрода при непрерывной его работе в течение продолжительного времени (концентрация глюкозь1 2,55 мМ, др., условия как в табл.1) приведена в табл. 2.
Чувствительность электрода в нача" ле увеличивается и в дальнейшем сохраняется на постоянном уровне в
Та блица 2.
О, 0,67
1,05
0,90
891774
Продолжение табл. 2
Продолжение табл.3
0,90
2,40
0,5
0,0
1 04
4,72
1,0
1,0
6,40
1,5
0,98. 8
7,92
2i0
I,0
9,04
2,5
9,76
3,0
3,5
10,40
Пример 2. Электрод изготавливают из 26 мг комплекса состава
ЙМФ ТЦХ1Г и погружают в раствор высокоочищенной пероксидазы иэ хрена В
0,1 М фосфатном буфере. Концентрация фермента 1(Г®моль/л (4 10 мг/мл) .
Адсорбция проводится в течение 2530 мин при 20 С. Ферментный электрод пропитывают фосфатнъм буфером и про" . водят определение тока электрода в зависимости от концентрации перекиси .водорода.
Зависимость катодного тока восстановйения перекиси водорода адсорбированной на комплексе МИФ ТЦХИ пер.оксидазой (20 C ipH 7,0,, 0,1 М фосфатный буфер) показана в табл.3 °
Электрод сохраняет работоспособ:.ность в течение суток. Когда на комплексе захватывается раствор нер" .оксидазы (0,1 мг/мл) при помощи диализной мембраны, электрод сохраняет активность более, чем в течение месяца.
Таблица 3.
2,64
0,5
0,05
5,04
1,0
6,88
1,5
8,32
2,0
2,5
9,52
10,48
3,0
0,5
2,48
0,10
4,80
1,0
6,72, 2,5
8,64
2,0
2,5
10,16
l1,68
12,80
3,0
3,5
13,84
4,0
0 5
2,24
+0,15
3,80
110
5,04
1,5
5,96
2,0 ок лектода, кА
Конце итра ция перекиси водо рода, мМ
Потенциал катода относительно наснценного хлорсеребряного элек трода, В
6,72
2,5
7,32
3,0
7,72
3,5
1,70
+О, 20
0 5
0 5
2,56
1,0
2,56
0,05
3,08
1,5
4,72
1,0
3,28
6,32
2,0
I 5
3,42
7,52
8,80 $5
9,60 !
0,32
2,5
2,0
3,52
3,0
2,5
3,0
3,58
3 5
3,5
1774
Таблица 5
Потенциал анода, В
Концентрация 0-, L-лактата, мМ
Ток электрода, мкА
0,4,, О
0,08
0,05
0,15
0,24
0,68
0,24
0,54
1,2О
Та блица 4
0,84
1,68
2,12
2,48
1,42
Потенциал анода Я
0,04
0 05
0,10
0,24
0,15
Таблица 6
0,,34
0,60 2
0,64
0,88
1,08
0,93
1,32
1,52
0,4
0,08
0 05
0,15
0,28
0,46
О., 92
0,24
0,54
1,28
1,92 зо
2,40
0,84
0,72
20
2,90
23
25
9 89
Пример 3. l мл комплекса состава ММФ ТЦХМ добавляют в 3 мл
0,1 M фосфатного буфера при рН 7,2 и температуре 20 С, содержащего 0,1 мг о цитохрома Ь активностью 70 ед/мг, выделенной из дрожжей "Hansenula
anoma1а". Полученную суспензию наносят на токоотводящий электрод (платиновый или из стеклоуглерода) и закрывают полупроницаемой мембраной.
На электрод подается потенциал в интервале 0,3-0,4 В (относительно
Ag/AgCl электрода сравнения) и измеряется зависимость стационарного тока после 1 мин при добавлении 0-, 1.-лактата.
Зависимость тока анодного окисления лактата адсорбированного на комплексе МИ 1 ЮТЦХИ цитохрома Ь (20 С, рН 7,2, 0,1 М фосфатного буфера) приведена в табл.4.
Концентра- Ток электция 0-, 1.- рода, мкА
-лактата, MM
Пример 4. 1,2 мг комплекса состава ММФ (ТЦХИ ) добавляют в
4 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН которого 7, 2 при 20 С, содержащего
0,1 мг цитохрома bz. Другие операции аналогичны примеру 3.
l0
Зависимость тока анодного окис. ления лактата, адсорбированного на комплексе ММФ (ТЦХИ )> цитохрома b (20 С, рН 7,2 0,1 М фосфатный буфер),, приведена в табл.5.
Зависимость тока ферментного электрода - цитохром Ь МИФ+(ТЦХИ ) от температуры (потенциал анода
0,1 В, концентрация 0«, L-лактата
3,57 мМ, 0,1 И Фосфатнйй буфер), приведена в табл.6.
Температура, .С Ток электрода, мкА
0,680
0,696
0,720
0,760
0,824
0,896
0,960
1,024
1,080
1,136
1,192
1,248
89) 774 (комплекс фосфатный электрода
Продолжение табл.6
1,312
1,368
1,416
27
1,456
1, 496
0,2
0,01
0,05
0,4
0,8
0,07
1,0
1,3
1,65
1,4
0,20
1,6
0,22
1,8
0,23
38
40
43
0,376
0,272
46
0,232
О, 200
Таблица 8
Концентрация глюкозы, мМ
Ток
Потенциал анода . относительно наэлектрода, мкА еыщенного хлорсеребряного электрода В
0,2
0,10
0,28
0,25
0,52
0.40
0,45
0,80
1,0
1,2
0,50
1,520
1, 544
1,552
1, 512
1,472
1,392
1,320
1,232
1,112
О, 976
0,848
0,696
0,568
О, 448
Пример 5. Таблетку прессуют из 12 мг комплекса ИМФ ТЦХ."1 диаметром 2 мм и толщиной около 0,5 мм выкладывают на торец электрода, изготовленного из впаянной в стекло и отшлифованной титановой проволоки.
Комплекс прижимают к электроду при помощи капроновой сетки (толщина нитей 0,1 мм, 160 меш). На сетку наносят 0,1 мм раствора глюкозооксидазы (1,3 мг/мл) и раствор закрывают целлофановой мембраной. Определяют ток электрода в присутствии глюкозы.
Зависимость разностного анодного тока глюкозоокспдазного электрода, в качестве токоотводящего электрода в котором служит титановая проволока
)2
))Мф+ТЦХМ", рН 7,2, 0,1 M буфер, 2э С, потенциал
0 В) приведена в табл.7, (Таблица 7
Концентрация Разностный анодный ток глюкозы, мМ электрода, мкА
Пример 6, 8,01 мл раствора глюкозооксидазы захватывают при помощи диализной мембраны на поверхности электрода из комплекса N-метилакридиний-ТЦХИ. Концентрация фермента 6,9 10 моль/л. Определяют
-ь
30 ток электрода в зависимости от концентрации глюкозы и потенциала электрода.
Зависимость анодного тока окисления глюкозы абсорбированной на комплексе NMA ТЦХМ глюкозооксидазой от концентрации субстрата (рН 7,0, 0,1 M фосфатный буфер, 25 С, анаэробная среда) приведена в табл.8.
891774
14!
1родолжение табл.8
Зависимость аиодного тока окисления L-лизина, адсорбиронаиной на .комплексе НИХ ТЦХИ оксидазой L-аминокислот от концентрации субстрата
% при 0,048 В относительно и.с.э. (рН 7,2, 0,1 И фосфатный буфер, 25 С, анаэробный раствор), приведена в табл.9, 2 J 3
1,4 0,60
1,6 0,70
2,0 0,90
Т а б л и ц а 9
2,6
l,02
О 0
0,28 0
0,3
Концентрация 1-лизина, MM ок электрода, мкА
0,52
0,05
0,80 0,12
0,21
0,42
0,63
1,0
1,5
0,1 или
0,048
2,0
0,28
0,15
0,52 0,35
П р и м е ч а н и я. 1. В случае мочевой кислоты и холестерииа калиб- .
$p ровка выполнена до 0,63 мИ субстратов.
Величины токов близки по значению к току электрода на основе оксидазы аминокислот.
2. Сравнительно небольшие токи электродов обусловлены низкой активностью используемых ферментов. Актив- ности которых равны.0,05; 0,12;
0,8 ед/мг соответственно для холестериноксидазы, уриказы и оксидазы
4p -аминокислот.
0,80
1,0
0,50
1,2
0,52
1,6
0,55
0,60
1,8
2,0
0,62
0,4
2 1
0,1
2,6
0,25
0,30
3,0
0,35
3,2
Пример 7 ° 0,10-0,12 мг лиофилизированного порошка оксидазы
L-аминокислоты (или уриказы, или холестериноксидазы) растворяют в
0,1 мл фосфатного буфера и раствор 50 наносят на поверхность электрода
N-метилхинолиний Т11ХИ, Раствор покрывают диализной мембраной. Электрод погружают в фосфатный буферный раствор н выдерживают в течение 0,5- у
1,5 ч при 25 С. Определяют ток электрода в зависимости от концентрации субстрата.
l,0 0,25
1,2 0,40
1,4 0,50
2,0 0,75
0 0
Пример 8. 15 ьр раствора диафоразы, выделенной йз митохондрий и обладающей НАДН"окивлительной способностью (0,2 ед/мг), захватывают в приэлектродном слое комплекса
М-метилпиридиний-ТЦХМ и проводят определения тока электрода в зависимости от концентрации субстрата.
Зависимость тока окисления НАДН» адсорбированной на комплексе
NMIIH ТЦХИ диафоразой от концентрации субстратов (потенциал анода
0,072 В относительно н.с.э., рН 7,2, 0,1 M фосфатный буфер, 25 С, ана эробный раствор), приведена в .табл.10.
891774
Формула изобретения
Таблица 10
1. Способ получения ферментных электродов, чувствительных к мета5 болитам, о т л и ч.а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения свойств целевого продукта, фермент адсорбируют .на органическом электроде, представляющем собой комплекс органических катионов метилированных производных феназина, акридина, хинолина, пиридина, дипиридина и анион-радикала 7,7,8,8-тетрациан-п-хинодиметана, и процесс проводят в растворе, соцержащем фермент в концентрации 10 -10 моль/л, -5Г при 4-25 С и рН 7,0-7,2 в течение
0,5-15 ч.
2. Способ по п.l, о т л и ч а ю—
26 шийся тем, что в качестве фер1 ментов используют гем-, флавии- и металлосодержащие,ферменты: глюкозо.оксидаэу, пероксидазу, лактатдегидро геназу, оксидазу О-.и 1.-Ж-аминокис2З лот, ксантиноксидазу, диафоразу, уриказу и холестериноксидазу.
Концентрация НАДН, мИ
Ток электрода, мкА
0,16
61
0,32
0,48
92
160
l,2
205
l,6
Таблица 11
1 Ток электрода, мкА. 1. 5.R.Betso, И.Н.Klapper, 1. .B.Anderson, J,Amer. Chem. Soc.
v. 94, 1972, р. 8197. .2. Авторское свидетельство СССР по заявке У 2791581/23-26, кл. С 25 В ll/12, 1979.
3. Иммобилизованные ферменты. Под ред. И.В. Березина, В.К.Антонова, К.Иартинека. И., ИГУ, 1976, т. 2, 4о с, 169-176.
4. Williams О.L., 0oig A.R. Jã., Korosi А. Electrochemical Enzymatic
Analysis of Blood.. Glucose and
Lactate, - "Аоа1. Chem". ч. 42, 1970, р. 118-121 (прототип).
5. L.Russell Ие1by. Сападian Ю, of Chemistry, ч. 43, 1965, р. 1448.
Концентрация глюкозь1 MN
0,01
0,2
0,03
0,3
0,06
0,5
0,8
1,1
1,5
0,15
0,22
0,31
0,41
l,9 е Ф
П р и и е р 9. 10 мл раствора глюкозооксидазы (69 MM) захватывают при помощи диализной мембраны на поверхности электрода из комплекса метилвиологен — ТЦХИ, определяют ток электрода в зависимости от концентрации глюкозы.
Зависимость тока окисления глюкозы,адсорбированной на, ИВ ТЦХИ глюкозооксидазой от .концентрации субстра та (0,048 В относительно н.с.э., другие условия, как s табл.З), приведена в табл.ll.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
891774
Составитель О.Скородумова
Техред М. Рейвес Корректор Г.Огар
Редактор Н. Рогулич
Заказ 11152/39, Тираж 531 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.; д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4