Способ получения пектолитического ферментного препарата из @

Способ получения пектолитического ферментного препарата из @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советскии

Социапистичесиик республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<»891775 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Задавлено 291279 (21) 2881439/23-04

{51)М. Кл. с присоелииением заявки 1ти

С 12 и 9/14

С 12 М .9/24

Государствсииый комитет (23) Приоритет

Опубликовано 231281. Бюллетень ЛВ 47

Дата опубликования описания 23.1 2,81 во девам изебретеиий и открытий (53) УДК 577.15. .07(088.8) А.К.Хасирджева, В.И.Максимов, Г.А.Молфдовй ---- -— и В.М.Румянцев (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОГО

ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ASPERG I LLUS FOET10US

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментной микробиологической промышленности, и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов мацерирующего действия из технических или частично очищенных ферментных препаратов или из их растворов, получаемых выращиванием гриба

Aspergi11us foetidus.

Данное изобретение решает задачу

1О получения высокоактивных ферментов, например, из Пектофоетидина П10х, обладающих свойствами биохимического реактива или медицинского терапевти15 ческого средства, применяемых для мацерирования растительных тканей.

Известен способ получения пектолитического ферментного препарата из

Aspergi1lusfoetidus заключающийся в приготовлении экстракта фермента, его концентрировании (обычно путем ультрафильтрации), внесении стабилизатора (А12 (SO4) в количестве

1-ЗХ) в ферментсодержащий раствор и последующей ет-о сушке распылением.

Ферментный экстракт получают по

,обычной методике, т.е. экстрагированием водой из поверхностной культуры гриба.

Пектолитическая активность в экстракте составляет 6 ед/мл, в конечном продукте 170-199 ед/мл (при влажности препарата 12"133) 11 ) и j2).

Недостатком известного способа является невозможность получения высокоактивного пектолнтического фер" ментного препарата (обладающего мацерирующим действием).

Цель изобретения - повышение активности получаемого иэ Aspergillus

foetidus пектолитического ферментного препарата.

Указанная цель достигается способом получения пектолитического фер" ментного препарата из Азрего111иэ

foet1dus, заключающимся в приготовле"

891775 4

1О

20 нии экстракта фермента, его хрома ro графической очистке (при активности

20-50 ед/мл исходного экстракта), концентрировании с последующим выделением целевого продукта осаждением

3-3,5 объемами органического раство рителя.

Приготовление экстракта фермента заключается в растворении в воде

Пектофоетидина П10х с активностью

100-200 ед/г в количестве 20—

25 вес.X в течение 12-18 ч при 3-8О С.

В качестве органического растворителя для осаждения используют этиловый, пропиловый или изопропиловый спирт либо ацетон.

Хроматографическую очистку фер ментного экстракта проводят по известной методике.

Предлагаемый способ позволяет получать пектолитический ферментный препарат с активностью до 7501200 ед/г (выход по активности—

60-757).

Получаемые препараты, обладают мацерирующей активностью, сопостави,мой (а в некоторых случаях превышающей) с активностью импортных препаратов, например Nacегоzyme R-lб" и могут быть использованы взамен дорогостоящих импортных препаратов.

Способ осуществляется следующим образом, В качестве исходного материала используют фермент Пектофоетидин

П.10х или осадок (невысушенный), полученный спиртовым осаждением концентрата вытяжки Пектофоетидина Пх.

Для приготовления экстракта из Пектофоетидина П10х берут концентрацию препарата в пределах 15-30Х, предпочтительно 20-25Х настаивают с водой 12-18 ч при охлаждении до 3-8 С.

Готовый экстракт с пектиназной активностью 22-50 ед/мл пропускают через хроматографическую колонку, наполненную гелем Акрилекс P-2, Р-6, собранный из колонки элюат концентрируют, например, вакуум-выпаркой или ультрафильтрацией в 3-9 раз, прерпочтительно в 4-6 раз, Из полученного концентрата раствора очищенного фермента выделяют препарат осаждением 3-3,5 объемами органического растворителя, например этанола, иэопропанола или ацетона.

Для получения высокоактивных препаратов фермента используют культуру гриба Aspergillus foetidus или

55 полученные из»ee препараты, например Пектофоетидин П10х. Нормальная работа хроматографической колонки обеспечивается при условии, что ферментный препарат Пектофоетидин П10х обладает активностью 100-200 ед/г и полученный из него экстракт активностью предпочтительно 40-50 ед/мл.

При этом получают препарат с активностью до 1000 ед/г и выше. Если концентрация Пектофоетидина П10х в экстракте выше 30%, .то получают плохо фильтруемые и трудно центрифугируемые экстракты, непригодные для .хроматографии ° При очень низких концентрациях ферментного препарата хроматографическая колонка работает неэффективно.

Хроматографию осуществляют используя одновременное нагнетание раствора снизу и отсасывание сверху колонки, производят вымывание высокомолекулярного вещества — фермента — элю1ирующим раствором, взятым в количестве 40-50Х от полного объема колонки, со скоростью подачи его в два раза превышающей скорость подачи раствора высокомолекулярного вещества.

На данной стадии очистки фермента достигается отделение от низкомолекулярных примесей (солей, аминокислот, углеводов и др ° ). .В качестве наполнителя колонки используют полиакриламидные гели типа Акрилекс. Из них

Акрипекс P-2 обеспечивает наибольшую скорость процесса, быстроту регене— рации и более многократное использование. С Акрилексом P-6 получают более качественное отделение пигментов, но скорость хроматографии на этом геле в 2-3 раза ниже, чем на Акрилексе Р-2, В качестве элюирующего раствора используют воду с небольшими добавками солей или без них.

Полученный из колонки элюат, раствор очищенного фермента, по частям или целиком подвергают концентрированию. Концентрирование осуществляют в 3-9 раз известным способом (ваку" ум-выпарка или ультрафильтрация).

Эта стадия необходима для снижения объема жидкости, увеличения концентрации фермента и уменьшения расхода органического растворителя ° После концентрирования в 3-9 раз фермент может быть полностью и без инактивации осажден 3-3,5 объемами органического растворителя, например этанола, изопропанола, ацетона.

891775

Таблица 1

Фракции Объем Активность Выход активносэлюата, в элюате, ти, 7. от нанесен. л. ед/мл на колонку

0,5

0,5

64

0,5

Сумма

1,5

Пример !. Для приготовления

25Х-ного экстракта 0,25 кг Пектофоетидина П.10х с активностью 120 ед/г, полученного с Рассказовског0 биохимического завода, смешивают с 0,75 л воды и оставляют в холодильнике (3-8 С) стоять в течение 16 ч. Центо рифугированием отделяют нерастворившуюся часть и получают 0,75 л экстракта. Весовая концентрация экстракта

0,5 л фракции ll упаривают на ро— торном испарителе при температуре

40 С и получают 0,078 л концентрата с активностью 265 ед/мл, выход количественный. Степень концентрирования 6,4 раза.

К 0,078 л концентрированного элюата при 0-5 С добавляют 0,23 л (3 объема) этанола, предварительно охлаж- 3$ денного до 0-5 С, перемешивают

15 мин, осадок отделяют центрифугированием при 2500 об/мин (10 мин).

Осадок высушивают в вакууме. Выход

l 1,,2 г, активность 1200 ед/г, выход 4о ло активности на стадии концентрирования, спиртового осаждения и высушивания 757. Общий выход пектиназы в расчете на исходный Пектофоетидин

П10х составляет 607. 4$

Пример 2. Для приготовления

20%-ного экстракта 0,2 кг пектофоетидина П10х с активностью 204 ед/г, полученного с Рассказовского биохимического завода, смешивают с 0,8 л $р о воды и оставляют на 17 ч при 5 С, центрифугируют в течение 45 мин при

2500 об/мин,получают экстракт объемом

О, 65 л с активностью около 50 ед/мл.

Весь экстракт вводят в колонку SS (О,! x l м) с гелем Акрилекс Р-2 и собирают две фракции объемом:

1,С л, 1J! -0,2 л. Фракцию Е лиофилизируют и получают 7 г препарата с по отношению к исходному фериентному препарату составляет 25Х активность в экстракте равна 36 ед/мл, общий выход на стадии составляет 907.

0,68 л экстракта пропускают через колонку с гелем Акрилекс Р-2 (диаметр колонки 10 см, высота около !

00 см) в соответствии с известным способом. Собирают три фракции. Результаты показаны в табл.1. активностью более 2000 ед/г. Фракцию Е концентрируют упариванием в 4,4 раза до объема 0,23 л. Концентрат делят на три части по 0,076 л каждая и из каждой части выделяют препараты, добавляя этиловый, пропиловый и изопропиловый спирты к каждой части соответственно.

Осаждение фермента спиртами осуществляют следующим образом.

К охлажденному до 5оС концентрату (0,076 л) добавляют при перемешивании 0,18 л (3,5 объема ) спирта, охлажденного до температуры (-5)(-15) С. Смесь перемешивают и через

l0-15 мин центрифугируют. Все три препарата имеют вес около 2,7 г каждый и их активность в пределах

750-850 ед/г. Наиболее светлый оса= док получается с этиловым спиртом.

Пример 3. Приготовление экстракта и хроматографию на колонке с Акрилексом P-2 осуществляют так же, как в примере 1.

Далее 0,95 л элюата с активностью

10160 ед/л разделяют на две части

0,18 и 0,77 л соответственно. Первую часть подвергают ультрафильтрации через мембрану M-20 (Амикон) под давлением 6,7 атм до объема 0;036 л в концентрате (кратность концентрирования 5), из которого фермент осаждают добавлением трех объемов

891775

Продолжение табл. 2.

0,5

9,15

0,5

2,5

Сумма 2,0

59

Формула изобретения

Таблица 2

0,5

0,5

5,2 17

ВНИИПИ Заказ 11153/3

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðoä, ул.Проектная,4 этанола, после высушивания осадка в вакууме получают 1,65 г препарата с активностью 810 ед/г. Выход по активности 1340 ед/г, что составляет 70% от первой части элюата. Вторую часть (0,77 л) подвергают вакуум-выпарке до объема 0,130 л (кратность упари1вания 5,9), из которого фермент осаждают добавлением 0,39 л (трех объемов) этанола, после высушивания осадка в вакууме получают 8,78 r с активностью 940 ед/г. Выход по активности

8250 ед/г, что близко к 100Х от второй части элюата. . Пример +. Приготовление экстракта, хроматографию и концентрирование проводят так же, как в примере 2. Полученный концентрат (0,24 л) разделяют на три части по

0 08 л каждая и из них выделяют ферментные препараты добавлением этилового и изопропилового спирта, а также ацетона по 0,24 л каждого.

Получают три препарата весом по 4,44,6 г и с активностью 900-1000 ep/г каждыйе

Пример 5. В качестве исходного ма"гаркала используют осадок (невысуаенный), полученный из сконцентрироэзнной вытяжки из Пектофоетидика Пх осаждением этанолом в соответствии с регламентом получения

Пектофоетидина П10х. Невысушенный осадок аолучают с ИОЗФП.

0,56 кг этого осадка обрабатывают

1 л воды и оставляют в холодильнике на 2 дня. Нерастворившуюся часть отделяют цеитрифугированием при

2500 об/иии s течение 45 мин, получают 1 л экстракта с пектолитической активностью 22,2 ед/мл.

0,7 л этого раствора пропускают через колонку с гелем Акрилекс P-2 (размеры колонки: диаметр 0,1 м, высота около 1 и), уравновешенную водой. Собирают 4 фракции с веществом (табл. 2) .

Х и И фракции концентрируют ультрафильтрацией на установке с мембраной M-20 в 6,5 и 4,5 раз соответст15 венно. Выход на стадии ультрафильтрации составляет 90Х Концентраты лиофилизируют. Общий выход по всем стадиям составляет 50Х. Активность

200-300 ед/г препарата.

1. Способ получения пектолитичес25 кого ферментного препарата из Asperдillus foetidus предусматривающий приготовление экстракта фермента и его концентрирование, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повыше511 ния активности целевого продукта, экстракт фермента с активностью 2050 ед/мл перед концентрированием подвергают хроматографической очистке, а целевой продукт выделяют из ферментного концентрата путем осаждения 3"3 5 объемами органического растворителя.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю

gg шийся тем, что экстракт фермента готовят растворением в воде Пектофоетидина П10х с активностью 100200 ед/г в количестве 20-25 вес Х в течение 12-18 ч при 3-8 С. о

3. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве органического растворителя используют этиловый, пропиловый или изопропиловый спирт или ацетон.

50 Ис точники информации, принятые во вкимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

11 659613, кл. С 12 О 13/1О, 1976 {прототип).

2. Авторское свидетельство СССР

9679588, кл. С 07 G 7/02, 1977.

9 Тираж 531, Подписное