Способ получения носителя для иммобилизации белков

Способ получения носителя для иммобилизации белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советсиин

Социалистические

Ресттубиин

ОП ИСАНИЕ

ИЗЬЬРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

897770

{61) Дополнительное к авт. свид-ву(22)Заявлено 18.07.77 (21) 2506847/23-04 с присоединением заявки М (23) Приоритет— (51)М. Кл.

С 07 F 7/02//

С 12 и 11/00

3Ьаударстеапа11 квинтет

СССР ае деяан нзебретеннй н аткритнй

Опубликовано 15;01.82. Бюллетень М "(53) УДК 577.15. .07(088.8) Дата опубликования описания 18 ° 01. 82 .

А.И. Кестнер, Х.Я. Кипперр К.А. Кив1тс

Х.P. — Â. Егоров, А.3. Зрин, А.К. Арен (72) Авторы изобретения

Таллинский политехнический институт научно-исследовательский институт пр биохимии НПО "Биохимреакти (7I ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ

БЕЛКОВ

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения носителей для иммобилизации биологически активных веществ, например ферментов. Полученные препараты могут найти применение в качестве катализаторов для проведения ферментативных реакций в химической, фармацевтической и пишевой промышленности.

В настоящее время для иммобилизации ферментов используется большое количество носителей как органической, так и неорганической природы.

Наибольшего внимания заслужзтвают органоминеральные материалы, в частности покрытые полимерами пористые кремнеземные материалы. Носители такого типа характеризуются хорошими гидродинамическими свойствами и достаточ-. ной стабильностью получаемых препаратов. Свойства получаемых препаратов во многом зависят от способа покрытия носителя полимерами и активации полимерного слоя на носителе.

В литературе описан ряд способов получения носителей для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим ппенкообразукщим веществом, содержащим реакционноспособные группы.

Известен способ, в котором в качестве пленкообразующего вещества используют полиакролеин. Носитель (hapфор, измельченное стекло) пропитывают мономером, содержащим свободные альдегидные группировки. Полимеризация происходит на поверхности носителя. В результате модификации носителя таким способом получают носитель со свободными альдегиднымн группами.

Иммобилизация фермента (трилсина, па" паина) производится через реакцию альдегидньм групп носителя с аминогруппами фермента (13 .

Недостатком этого способа является малая операционная стабильность получаемых активированных носителей.

Покрытие неорганического материала линейными полимерами, обраэукж1имися при полимеризации винильных полимеров, не обеспечивает достаточную нерастворимость, а следовательно, стабильность получаемых ферментных препаратов. Этот способ также ограничивает модификацию носителя альдегидсодержащими полимврамн, а свяэываниеферментов только через альдегидные группы не всегда дает возможность получить препараты с высокой активностью и высокой стабильностью. Известный способ не обеспечивает также и высокого содержания белка на единицу носителя. (При иммобилизации трипсина достигается связывание до 0,2 мг белка иа 1 мл носителя)

Известен также способ получения носителей для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического носителя органическим плеико-: образующим веществом. В качестве .т пленкообразующего вещества используют эпоксидную смолу. отверждение которой на носителе проводят при помощи полиэтиленполиамнна. Носитель далее активируют при помощи реагентов, выбранных из группы, включащей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой кислоты, пара-бензохинон t.2 .

Недостатком этого способа является невозможность несложной регенерации носителя после инактивации иммобилизованного фермента в процессе его использования, небольшая реакционостой кость и стабильность носителя.

Целью изобретения является повышение реакцноноспособности носителей относительно белков, повышение стабильности получаемых коньюгатов и обеспечение регенерации носителя.

Цель достигается тем, что согласно способу получения носителя для иммоби лизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразуккцнм веществом, содержащим реакционноспособные группы, с последукщей активацией носителя реагентами, выбранными из группы, включающей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой кислоты или пара-бензохинои, неорганический носитель пропитывают растворами адипиновой кислоты и 1,6-гексаметилендиамина в соотношении эквивапентов адипиновой кислоты и 1,6-гексаметилендиамина

1:1,5 после чего осуществляют поли7770 конденсацию при 180-200 С в атмосфере инертного газа в течение 2-3 ч.

Способ осуществляется следующим

;образом.

Неорганический материал, предпочтительно силохром или силикагель, смачивают водным раствором, содержащим адипиновую кислоту и 1,6-гексаметилендиамин в соотношении эквива16 лентов адипиновой кислоты и диамина

1 .1 5. Носитель высушивают при 140 С и после высушивания прокаливают в . специальной трубке в атмосфере пропан бутана при 180-200 С в течение 2-3 ч.

Ф

15 Затем носитель промывают водой и ацетоном и сушат при 120 С. Полученный носитель (с содержанием активных аминогрупп в количестве 5Q мк экв на 1 г носителя) используют для иммобилизаэе ции протеолитических ферментов {трипсина, химотрипсина, панкреатина) с помощью бифуикциональных реагентов, таких, как глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой кислоты или

25 пара-бензохинон.

Л р и м е р 1. Получение носителя, модифБцированного полиамидом.

Для получения носителя проводят реакцию полимеризации адипиновой кислоты и гексаметилендиам на в порах носителя при количестве амкна свьппе эквимолярного(соотношение эквивалентов 1:1,5). 5 г силохрома или силикагеля смачивают 7 мл водного раствора, содержащего 0,13 r адипиновой кислоты и 0,16 r 1,6"гексаметилендиаы на.

Смоченный носитель.* высушивают при

140 С, проиаливают в специальной трубке (обмотанной нагревательной хромоникелевой проволокой) диаметром 40 мм

40 в атмосфере пропан-бутана при 180200 С в течение 2 ч. Затем промывают водой и ацетоном и высушивают при

120 С.

В результате получают носитель, содержащий на поверхности активные аминогруппы в количестве 50 мк экв на l r носителя. Полученный носитель используют для иммобилизации протеолитических ферментов (трипсина, химоЖ трипсина, панкреатина) с помощью бифункционапьных реагентов, таких как глутаровый альдегид, диизоц-:.:::.нгт адипиновой кислоты и п-бензохинон.

Пример 2. Получение нераст55 воримого ферментного препарата с использованием носителя, модифицированного полиамидом, актит; — рс:; аННрМ ! глутаровым .альдегидам. 897770

3S

SO

К модифицированному погыамидом носителю (5 г) добавляют 15 мл

2%-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь перемешивают и выдерживают при комнатной темп ратуре в течение 2 ч. После этого материал отмывают дистиллированной водой от глутарового альдегида на воронке

Бюхнера до исчезновения глутарового альдегида в промывных водах и к влажному активированному носителю добавляют 5 мл раствора фермента (химотрипсина) с концентрацией 50 мг/мп в боратном буфере рН 8,0. Смесь перемешивают для удаления воздуха из пор и выдерживают при 20- С .в течение ч. После инкубации препарат промгвают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0 l M раствором хлористого натрия и затем епге боратным буЬером, добавляя эти растворы порциями. Объем промывных вод составляет 100 мл.

Полученный иммобилизованньЖ препарат хранят во влажном виде в боратном буфере в холодильнике.

Содержание белка з препарате химотрипсина, определенное.по модифицированному методу Поури, составляет 15,5 мг/г (45% от количества, использованного для иммобилизации).

Ферментативную активность препарата определяют на синтетическом субстрате этилового эфира ацетил-l-тирозина (АТЭЭ). Препарат обладает активностью 1550 E/I.. Выход иммобилизации по активности составляет 8,0Х.

Стабильность препарата при операционных условиях оценивают по остаточной активности после проведения гидоолиза 2%-ного раствора казенны с рН 8,0. при 30 С в течение 17 ч в реакторе с активным ротором (контрольный гид.ролиэ). После такого гидролиза препарат иммобилизованного химотринсина обладает активностью 1050 Е/г, что составляет 68% от исходной..

П р и и е р 3. Получение нерастворимого Ьерментного препарата с использованием носителя, модиЬицированного полиамидом, активированием диизоцианатом адипиновой кислоты.

К 5 r модиЬицированного полиамидом носителя (пример 1) добавляют 20 мп

0,25 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле и смесь кипяо тят при 110 С в течение ) ч. После этого носитель Ьильтруют, промывают

Р ацетоном и вггсунизают при 110 С в течение 1 ч, Вследствие такой обработки получают носитель с активными изоцианатными группами. Носитель смачивают 8 мп боратного буЬера. Иммобилиэацию химотрипсина проводят, как описано в примере 2. Получают препарат химотрипсина с активностью на

АТЭЭ 2400 Е/г; выход иммобилизации по активности составляет 18,6Х. Содержание в препарате белка 16,8 мг/г и выход белка 48,8Х.

После контрольного ггщролиза препарат обладает активностью в количестве 44% от исходной.

Пример 4. Получение нерастворимого ферментного препарата (иммобилизованного химотрипсина) с использованием носителя, модиЬицированного нолиагягдом, активированием и-бензохнноном

5 г модифицированного полиамидом носителя (пример 1) нагревают с 20 мп

0,5Х-ного водного раствора и-бензохинона на водяной бане в течение 1 ч.

Затем носитель промывают водой и ацетоном и высушивают при комнатной температуре. Активированньп носитель смачивают 8 мп боратного буфера.Иммобилизацию химотрипсина проводят, как описано в примере 2. Получают препарат с активностью 7200 Е/г (на

АТЭЭ); выход иьягобилизации по активности составляет 37,2Х. Содержание белка в препарате составляет 21,2 мг/r и выход белка 61,6%. После контрольного гидролиза препарат обладает активностью 60Х от исходной.

Пример 5. Получение нерастворимого Ьерментного препарата (иммобилиэированиого панкреатина) с использованием носителя, модиЬицированного полиамидом, активированнем п-беизохиноном.

5 г модифицированного полиамидом носителя (пример 1) обрабатывают п-бензохиноном. как в примере l Лктивированггый носитель смачивают 8 мп боратного буфера. Иммобилизации панкреатина проводят, как описано в примере 2, с тем различием, что концентрация фермента составляет 80 мг/мп.

Получают нерастворимый препарат панкреатина с активностью 17,4 Е/г (активность определяют на 2Х-ном растворе казеина), Выход иммобилизации IIQ активности 23,6Х Содержание белка в препарате составляет 24,2 мг/г и выход белка 56Х. После контрольного гидролиза сохраняется 58% от исходной активности.

897770

Формула . изобретения

Составитель А. Бочаров

Редактор 3I. Веселовская Техред C. Мигунова Корректор У. Пономаренко

Заказ 11869/33 Тираж 389 Подписное

ВН1ЫПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113() Зэ 11осква H-35 I àóøñêàÿ наб, z д. 4/5

Фи1нтял Л11П Пятец, г. Ужгород, ул, Проектная, Пример 6. Получение регенерированного носителя, пригодного для последукщего модифицирования полимерами.

Для удаления полиамидного покрытия с поверхности пор кремнеземсодержащего материала и возобновления свойств поверхности его проводят гидролиз с минеральной кислотой при кипячении.

100 r регенерируемого носителя помещают в 1-литровую колбу, снабженную механической мешалкой. Добавляют 500 мп 1 н соляной кислоты и кипятят при перемешивании (600800 об/мин) в течение 1 ч. После этого раствор декантируют и носитель моют два раза горячей водой. Затем носитель высушивают на кювете при комнатной температуре или в термостате при 140 С.

Способ получения носителя для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, содержащим реакционноспособные группы с последующей активацией носителя реагентами, выбранными из группы, включающей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой кислоты или пара-бензохинон, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения реакционной способности носителя, 10 повьппения стабильности получаемых конъюгатов и обеспечения регенерации носителя, неорганический носитель .пропитывают растворами адипиновой кислоты и 1,6-гексаметилеидиамина в соотношении эквивалентов адипиновой кислоты и 1,6-гексаметилендиамина

1:1,5, после чего осуществляют поликонденсацию при 180-200 С в атмосфере инертного газа в течение 2-3 ч.

20 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Великобритании Ф 1342136, кл. С 03 Н 1/02, опублик. 1973.

2. Авторское свидетельство СССР

2д по заявке Ф 2490496/23-04, кл. кл. С 07 11 7/02, 1977 (прототип).