Способ получения полипептидов
Патент 904518
Авторы
Способ получения полипептидов
Иллюстрации
Реферат
Союз Соватскик
Социалистичесюа
Республик
Q П И С А Н И Е (п)904518
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К ПАТЕНТУ (6т1 дополнительный к патенту (22) Заявлено 080477 (21) 2470259/23-04
08.04.76;21.05.76 (23) Приоритет - (32)27. 05 76;14. 07. 76
14362/У?6,"21063/76. 28. 10. 76; 28. 10. 76 (3))22055/76; 29298/76. (33) Великобритания
44837/76,44838/76
Опубликовано 070282. Бюллетень 3ЧЪ5
3. (5l) М. Кл, С 07 С 103/52//
A 61 К 37/02
9мудэравквва кантат
СССР ао аллеи кзобрвтеикк к еткрыткк (53) УД)< 547 964. .4.07 (088. 8) Дата опубликования описания 070282
Иностранцы
Ананд Сваруп Дутта (Индия) Джеймс Джозеф Гормли, Кристофер фреде ик Хзйвард, Джон Селвин Иорли и Джильберт Джозеф Стейси; (Великобритания) Иностранная фирма
"Империал Кемикал Индастриз Ли тед" (Великобритания} (72) Авторы изобретения (71) Заявктель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЮЛИПЕПТИДОВ
F
Изобретение относится к способу получения полипептидов - новых соединений, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине. 5
Известен способ получения пептидных цепей путем отщепления различных блокирующих групп от соответствующих защищенных соединений (1 j.
Использование известных методов 10 позволяет получить новые соединения пептидной структуры.
Цель изобретения - получение новых полипептидов, обладающих фармакологическими свойствами. 1Ь
Поставленная цель достигается способом получения полипептидоз формулы где Й,1 - атом водорода, метильный или ацильный радикал, атом водорода; 11-f>-Ala;
Н-Asp; Н-Lys; Н-1дя (Вос);
ii-Gly-Gl 1 -As1 "H-1,уя;
Н-Ly Н-Lys, Н-Arg-Pro-Lys; К.йХ-Б»
Н-Gfu-Gly-Oi Н-Lys;
Н-Pro-Gln-Gln; Н-Asp-Г1у-Gly-Gly; 11-Lys-Gly-Gly-Gly;
11-Gly-Gly-С1уПТ-Lys;
Н-Ar -Pro-Lys-Pro-Gln-(ln
Н- lu; Н-D-L) s; 1!-РЬе- Г Lys;
И-Gly-Gly-Я> -С1> -Gly-ыу.. — D-Ala; D-Asp; Azala; D-b и, D-Ser, D-Thr; D-Trp; P-Ala;
D-Ser (Bu+); D-1.уз или
D-Met;
Gly или Azgly;
Phe; Azphe или Phe (6Н);
Leu; Azleu; Nle; Met; Pro, DL-Leu или Azpro;
- CNe; Я1, 0(G{z)zi iiz, 0(ж „Ы ; а1; О(Ш,),(Xi;
0(СН2ЬСАС; 0(С112320ск„ь;
ССН);11(аЛс) СНаЛс;
904518
3 оси сн(оса „. и ) си ОСО н „;
ОС1(СНдОАс); ОСН (СН1ОСОС 1 ;
Obu; Tl r-ОН; 3Щ
К О; %Kt;
О(СЩЯ12; 0(СН ) Ы1е2;
ОС асН=а1а.; Орп; <>i(CHz)z 01 @(С" ) 2!4™ Н(2)2 1е2
N&tg, Ме; 0(CHg)zG&Ie;
D-Thr-OH, или G u K вместе представляют собой 5 94) 2 " Ф5 И
OCI I (CIQOAc); Оа1(СН ОСОС I I„„)>
OBu+; Thr (Bz1); )Дн
Я О,; М ft;
1; О(СН ),reZ; 0(CH V.IZ;
ОС СН=С: 1„ОГ1; V;I(CI-I ),СЯ;
NH(CII<)g.ЯР1е; М1(а! ЦФ е
NEtg, 1Ь; 0(CIIQ GÏÜ или
D- TIrr-0Hz 1
1 или G и К вместе представляют собой
35 (й) Ц (СН 0 ("Я 2) )1Щ (CH2I2—
Ий -о;"H "о " " N Н щ -о Н вЂ” î + — "H т —
20 заключающимися в том, что отщепляют защитные группы в соединении формулы
В (1 где R
RgТ
В
Е (GI
К водород, метильный или ацетильный радикал; водород; Z; Н-В-А1а; Z-Asp;
2-Lys; 2-Lys I, Z); Z-Еуя (ВрД
Н-Gly-G1 Z-А р (OBzl) Z- yq
2-Lys(Z). "-Lys; .-Arg(22)—
-Pro-Lys,Z); Z-Gly-G1y-Гlу;
Z-Leu-Leo-Leu; 2-Glu-Gly-OBzl ZLys Z-Pro-Gln-G1n;
2-Asp(OBzl) -Gly-Gly-Gly;
Z-Lys-Gly-G1y-Gl или
2-С1у-Gly-Gly Z-Lys;
Z Arg(Z) -Pro-Lys(Z)-Pro-Gln-Г>1п; Вос; Н-6lu(OBu ); и ао
Boc-Lys(Boc); и-D-Lys 3oc);
Н-Lys(Boc); Boc-Pli iI-Ly
Вос-Gly-Gly-Gly или Boc-Gly-Gly-Гlу-Gly-Gly-Gly;
Туг; Tyr(Bzl); Tyr(Z) или
Tyr (Bu );
D-Ala; D-Asp; Azala; D-Leu;
D-Ser; 13-Thr; D-Trp; P-А1а;
D-Ser(Bu ) D-Lys
D-Lys(Boc) или Р- let;
Gly или Azgly;
Phe; Azphe или Рпе(би);
Leu; Azleu; Nle; Met; Pro;
DL-Leu или Azpro; д 1е1 " 2 0(а1232 Ъ ю
0(GI2)z%ще, ОН; 0(СНАЯ.Д1;
0(а12Ь ОАс, О(а12)2 Ocrxjeip
Ла I GI (OAc) CI I zOAc;
Получение исходных соединений осуществляют при использовании различных методов пептидной химии, например карбодиимидного или азидного метода получения смешанных ангидридов и т.п. 12). При этом получают исходные соединения, блокированные различными защитными группами. Например, для блокировки иминогруппы используют бензилоксикарбонил, трет„ -бутоксикарбонил. Гидроксильную группу защицают бензилом или трет.-бутилом, карбоксильную группу защищают, получая эфирметиловый или этиловый спирт. Для снятия этих групп применяют известные методы. Так, бензил или бензилоксикарбонил удаляют гидрогенолизом, трет.-бутоксикарбонил или трет.-бутил - обработкой исходного соединения кислотой, например трифторуксусной, или хлористым водородом. Для удаления бензилоксикарбонила или трет.-бутоксикарбонила используют бромистый водород в уксусной .кислоте. Иетиловый или этиловый эфир расцепляют с помощью гидрогенолиза или щелочной обработкой исходного продукта.
Восходящую тонкослойную хроматографию проводят на пластинах, покрытых силикагелем (Кизельгур 6). Хроматографирование проводят в следующих системах растворителей: бутанол-1 - уксусная кислота — вода
4;1:5 об.ч. (В А); бутанол-1 — уксусная кислота - вода - пиридин
15: 3: 12: 10 об. ч. (RgB); бутанол-2 (3 вес.Ф) — водный раствор аммиака
3:1 об.ч. (I@C) ацетонитрил — вода
904518
3: 1 об. ч. (R(D); ацетон — хлороформ
1:1 об.ч. (RgE); хлороформ - этанол
1:4 об.ч. (RgF); циклогексан - этилацетат 1:1 об,u. (R E>); циклогексанэтилацетат — метанол 1:1:I об;ч.
{Е Щ; хлороформ - метанол - вода
11:8:2 об.ч. (1л>-К); хлороформ — метанол 19:1 об,ч. (RyP) и хлороформ - метанол 9:1 об.ч. (R
> идролиэаты кислого характера для всех продуктов получают нагреванием пептида или блокированного пептида с 6 н.раствором соляной кислоты, содержащим 1 вес.об.3 фенола, в за- 2S паянной пробирке, иэ которой выкачен воздух, в течение 16 ч при 110 С.
Аминокислотой состав каждого гид" ролизата определен с помощью анализатора аминокислот Локарта. В каж- зв дои случае наблюдают соответствие с ожидаемым составом.
Il р и м е р ы 1-42. Блокированный полипептид подвергают восстановительному расщеплению.
Восстановительное расщепление осуществляют следующим образом.
Нl. Исходный материал в количестве 1 ммоль растворяют в этаноле, содержащем до 25/ воды, и в атмосфе- 4я ре азота добавляют 5 вес.Ф катализатора, содержащего 5 вес. палладированного угля, и ч-рез перемешиваемую реакционную смесь при 20-25 С осторожно барботируют поток водоро- 4л да. Для полного завершения реакции достаточно 5-6 ч. Водород заменяют азотом, и катализатор фильтруют через слой диатомовой земли. Продукт выделяют упариванием фиг,ьтрата в вакууме. Выход 90-95/.
Н2. Осуществляют> как и в Hl, но вместо водного этанола применяют метанол.
Н3. Осуществляют, как и в Hl, но применяют метанол в качестве реакционной среды.
Н4. Осуществляют, как и в Нl, но применяют водный этанол при добавлении 1 экв,ч. хлористого водорода.
Н5. Осуществляют, как и в Hl, но применяют водный метанол при добавлении 1 экв.ч. хлористого водорода.
Нб., Осуществляют, как и в Hl, но применяют диметилформамид при добавлении I экв.ч. толуол-и-сульфокислоты.
Н,>. Осуществляют, как и в Hl, но применяют метанол при добавлении экв.ч. хлористого водорода.
Н8. Осуществляют, как и в HI, но применяют в качестве реакционной среды смесь диметилформамида с бутанолом.
Н9. Осуществляют, как и в Нl, но применяют s качестве реакционной среды водную (90-95 об.Ф) уксусную кислоту., Н10. Осуществляют, как и в Н9, но добавляют 1-2 экв.ч. хлористого водорода.
Нll. Осуществляют, как и в Нl, но применяют в качестве реакционной среды водный диметилформамид.
Н12. Осуществляют, как и в Нl, но применяют в качестве реакционной среды смесь водного этанола и хло- . роформа.
Н13. Осуществляют, как и в Нl, но применяют в качестве реакционной среды смесь метанола в диметилформамиде.
В результате получают полипептидные производные, приведенные в табл. 1.
Пример ы 43-69. Блокированный полипептид подвергают расщеплению хлористым водородом по следующим методикам.
EI. Исходное соединение растворяют в этилэцетате и добавляют раствор хлористого водорода в этилацетате в количестве, достаточном для получе- ния 2-6 н.кислоты. Реакцию проводят при 20-25 С в течение 1-2 ч. Хлоргидрат продукта осаждают и отфильтровывают. Выделение проводят упариванием в вакууме.
Е2. Осуществляют, как и в Еl, но в качестве реакционной среды вместо этилацетата применяют метанол.
Е3. Осуществляют, как и в Е1, но применяют хлористый водород в смеси метанола с этилацетатом.
Е4. Осуществляют, как и a El, но применяют уксусную кислоту для раст4518
Сефадексе G 15 соляной кислоты.
Сефадексе G 25 кислоты.
12. Очищают на в 0,01 И растворе
13. Очищают на в 5 об.3 уксусной ворения исходного материала с последующим добавлением хлористого водорода в этилацетате.
Е5. Осуществляют, как и в Е2, но в атмосфере азота в присутствии противонагарного средства, например
2-меркаптоэтанола.
Еб. Осуществляют, как и в El, но применяют диэтиловый эфир вместо этилацетата в качестве реакционной среды.
Е7. Осуществляют, как и в Еl, но в качестве реакционной смеси вместо этилацетата применяют диоксан.
ЕВ. Осуществляют, как и в Еl, но в качестве реакционной среды применяют уксусную кислоту вместо этилацетата.
Е9. Осуществляют, как и в Еl, но в атмосфере азота в присутствии противонагарного средства, например
2-меркаптоэтанола.
Е10. Блокированный материал перемешивают с концентрированной соляной о кислотой (примерно 10 мл/г) при 0 С в течение 10 мин. Избыток кислоты затем отгоняют в вакууме, по воэможности при минимальной температуре, и полученный поодукт сушат лиофили" зацией.
В результате получают полипептидные производные, приведенные в табл. 2.
Примечания (сноски) к табл. 2.
1. Соль НС1
2. Соль 2НС1
3. Выделяют упариванием после фильтрования через диатомовую землю
4. Выделяют осаждением
5. Осаждают добавлением эфира
6. Осаждают добавлением смеси метанола с эфиром
7. Кристаллиэуют иэ смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С).
8. Получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет.-бутанолом.
9. См.сноску 8, в присутствии HCl.
10. Очищают хроматографией на кремнеземе с применением растворителя О.
11. См.сноску 10, с применением растворителя. К.
14, Т.пл. 202-205 С
15. 1.пл. 110 С
16. Т,пл. 179-180 С
17. Т.пл. 173-174 С
l8, Т. 142-144 Ñ
19. Т.пл. 118-120 C
20. Т.пл, 138-140 С
21. Т.пл. 111-114 С
22. Т.пл. 195-200 С (с разл.)
23. Т.пл. 120- 122 С
24. Т.пл. 174-176 С (с раэл.)
25 Т.пл. 120-124 С
Пример ы 70-88. Блокированный полипептид подвергают расщеплению с помощью трифторуксусной кислоты по следующим методикам.
F1. Исходное соединение растворяют в трифторуксусной кислоте (10 мл/г) и проводят реакцию при 2025 С в течение 1-2 ч. Продукт выделяют в виде трифторацетата упариванием раствора в вакууме. Используя лиофильную сушку в присутствии не"большого избытка хлористого водород да, получают соответствующий хлоргидрат.
F2. Осуществляют, как и в Fl, но применяют водную (90 или 95 об.3) трифторуксусную кислоту.
F3, Осуществляют, как и в Fl, но применяют водную (90 или 95 об.4) трифторуксусную кислоту е атмосфере азота в присутствии противонагарного средства, например 2-меркаптоэтанола.
Примечания (сноски) к табл. 3
1. Соль Hcl
2. Соль уксусной кислоты
Соль трифторуксусной кислоты (ТфК)
4. Соль 2ТФК
5. Выделяют осаждением после фильтрования через диатомовую землю.
6. Осаждают добавлением петролейного эфира (т.кип. 60-80 С)
7. Выделяют в виде высушенного лиофильной сушкой порошка иэ воды или смеси воды с трет.-бутанолом.
8. См. сноску 7, в присутствии
НС1.
9. Очищают на Сефадексе G 15 в
5 об.3 водной уксусной кислоты.
T.пл, 150-155 С
11. Т.пл. 166-168 С
fl p и м е р 89, l(235 мг (330 мкмоль) раствора Н-Т>т-В-Ser-Gly-Phe(6H)-Ley-Юле (исходное соединение 110) в метаноле (5 мл) добавляют l н.раствор гидроокиси натрия (1,0 мл, 3. экв.ч.), смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 3 ч. Раствог упаривают в вакууме, разбавляют водой и подкисляют разбавленным раствором соляной кислоты. После осветления фильтрованием раствор подвергают лиофильной сушке, продукт растворяют в водном 50/-ном растворе уксусной кислоты и пропускают через колонку, заполненную Сафадексом G 15, элюат вновь лиофилизуют, получают Н-Тут-D-Ser-Яу-РЬе(бН)-Leu-ОН, RyC 0,38.
Пример 90. При обработке
Н-Ме-D-Ser-Gly-Phe(6H)-1.еи-Ое (исходное соединение 102) в водном растворе гидроокисью натрия (2 экв.) с последующим проведением процесса по методике примера 8g получают
Н-lie-Р-Ser-Gly-Phe(бН)-Leu-QH, Rg 0,44.
Пример gl 140мг (224 мкмоль } Ас-Tyr-D-А1а-Г1у-Phe-Leu-Зле (исходное соединение 123) растворяют в 10 мл теплого диоксана и постепенно температуру раствора доводят до температуры окружающей среды, после чего добавляют 12 мл воды и 1 н.водный раствор гидроокиси натрия (0,75 мл, 3,5 экв.ч.). Смесь интенсивно перемешивают при температуре окружающей среды в течение
2,5 ч, затем большую часть диоксана отгоняют в вакууме. Остаток подкисляют добавлением 1 н.раствора соляной кислоты. Полученную суспензию концентрируют в вакууме. К остатку добавляют водный аммиак вместе с водным 0,05 М раствором ацетата аммония до получения прозрачного раствора. Изыбток аммиака упаривают и продукт чистят на колонке, заполненной Сефадексом G 25, в водном
0,05 И растворе ацетата аммония.
Элюат лиофилизуют, получают
Ac- Tyr-D-Ala-G1y-1Ъе-Leu-OH, R D
0 56, RgD О, 47.
Способы, указываемые в таблицах значениями Hl-Н13 включительно, Е1-Å10 включительно и Гi-Г3 включительно соответствуют значениям, приведенным, соответственно, в примерах 1-42, 43-69 и 70-88. Другие значения расшифровываются ниже.
Реакции активного сложного эфира
Аl. Раствор подходящего аминосоединения (1 моль) и соответствующего активного сложного эфира (1,1 ммоль) в диметилформамиде (ми9 4518 10 нимальный объем ) выдерживают при
20-25 С до отсутствия положительной реакции с. нингидрином 15-50 ч. Реакционную смесь концентрируют в вакууме и выделяют неочищенный продукт или осаждением его при добавлении подходящего органического растворителя, или обработкой водой, или смесью воды и подходящего органиto ческого растворителя, например эфира.
При необходимости осуществляют дополнительную очистку.
А2. Осуществляют, как и e Al, за исключением того, что в качестве
15 реакционной среды применяют этилацетат при 4 С.
А3. Осуществляют, как и в Аl, но при добавлении 1-оксибензотриазола (примерно 0,2 ммоль).
go А4. Осуществляют, как и в Аl, но реакционную смесь выдерживают при 4 C.
А5. Осуществляют, как и в Al, но при добавлении 1-оксибензотриазола (примерно 0,2 ммоль), и всю смесь
2s выдерживают при 4 С.
Реакции смешанного ангидрида
81. Раствор подходящего кйрбоксилсодержащего компонента (1 ммоль) в диметилформамиде (примерно 5 мл) охз0 лаждают до температуры от -20 до
40 С и обрабатывают N-метилморфолином (1,05 ммоль), а затеи изобутилхлороформиатом (1,05 ммоль). Смесь перемешивают при zåìïåðàòóðå от -20 о до -40 С s течение 5 мин, а затем добавляют раствор аминокомпонента (1 ммоль) в диметилформамиде. При использовании соли аминокомпонента добавляют также N-метилморфолин
4 (1 ммоль). Смесь перемешивают при
20-25 С до 24 ч завершения реакции, затем ее упаривают в вакууме. Остаток распределяют между разбавленным водным раствором лимонной кислоты
4 и подходящим, не смешивающимся с водой органическим растворителем, обычно с этилацетатом.
Продукт переходит в органическую фазу, которую отделяют и промывают водным раствором лимонной кислоты и водным раствором бикарбоната натрия, сушат и упаривают в вакууме. Если не найден подходящий растворитель, то промывают сухое вещество, которое
55 затем выделяют фильтрованием после окончательной промывки водой.
В2. Осуществляют, как и в Bl но в качестве третичного основания применяют триэтиламин.
904518
83. Осуществляют,как и в В1, но применяют этилхлорформиат с образованием смешанного ангидрида.
84, Осуществляют, как и в Bl, но смешанный ангидрид получают с этилхлорформиатом и N-метилморфолином в тетрагидрофуране.
25. Осуществляют, как и в Bl, но смешанный ангидрид получают с этилхпорформиатом и в качестве третичного основания применяют триэтиламин.
Реакци51 азида
Сl, Гидразид (1 ммоль) карбоксильного компонента растворяют в диметипформамиде (примерно 5 мл), охлаждают до -20 С и превращают в азид обработкой 6 М раствором хлористого водорода (5-6 ммоль) в диоксане, а затем в трет.-бутилнитрите (1,2 ммоль). Исчезновение гидразида из раствора выявляют нанесением смеси на фильтровальную бумагу с последующим добавлением смеси хлорного железа и феррицианида калия. Смесь перемешивают в течение 10 мин при
-10 С и нейтрализуют добавлением эквивалентного количества триэтиламина (т.е. 5-6 ммоль) и необходимого аминокомпонента (1 ммоль), растворенного в диметилформамиде (3 мл). При использовании соли аминокомпонента на этой стадии также добавляют требуемое количество триэтиламина (1 ммоль). Реакционную смесь затем о перемешивают при 0-4 С в течение
18-24 ч. Осадок отфильтровываю, фильтрат упаривают в вакууме и остаток, растворенный в растворителе, не смешивающемся с водой, промывают водной лимонной кислотой, водным раствором бикарбоната натрия и водой, продукт выделяют или упариванием раствора или фильтрованием, если выпадает осадок.
Реакции N>N -дициклогексилкарбодиимида
Дl, Подходящий карбоксилсодержащий компонент (1 ммоль) растворяют в диметилформамиде (5 мл) и перемешивают при 4 С при добавлении N,N—
-дициклогексилкарбодиимида (1,1 ммоль) и необходимого аминокомпонента (1 ммоль). Смесь продолжаO ют перемешивать при 4 С (или в некоторых случаях при 20-25 С,2 до отсутствия положитепьной реакции на нингидрин (до 18 ч). Если аминокомпонент берут в виде соли, то к реак45
56
С!. Для получения производнь1х гексагидрофенилаланина подходящее промежуточное соединение, содержащее фенилапанин (1 ммоль) растворяют в 803-ном водном растворе уксусной кислоты, возможно содержащей некоторое количество хлористого водорода, добавляют катализатор Адамса из окиси платины (50-150 мг) и проводят восстановление пропусканием потока водорода через перемешиваемую смесь при 20-25РС до завершения реакции.
Катализатор отделяют фильтрованием раствора через слой диатомовой земли, фильтрат упаривают в вакууме.
Гидролиз сложного эфира
Д1. Сложный эфир (1 ммоль) растворяют в водном 753-ном ацетоне (1015 мл), содержащем гидроокись натрия 11,1-1,2 ммопь1 и раствор перемешивают при 20-25 С до прекращения реакции, что подтверждают спустя ционной массе добавляют в на -.:ле реакции триэтиламин (1 ммоль). Осадок отфильтровывают, продукт выделяют упариванием фильтрата в вакууме, 5 остаток растворяют в подходящем органическом растворителе, например в этипацетате, и промывают последовательно водным раствором лимонной кислоты, водным раствором бикарбо-!
О ната натрия и водой, после чего высушенный экстракт упаривают или осаждают продукт добавлением подходящего осадителя, например петроМейного эфира (т.кип. 60-80 С).
Д2. Осуществляют, как и в Дl, но при добавлении к реакционной смеси .
1-окси бензотриазола (2 ммоль).
Д3, Подходящее карбоксилсодержащее соединение.(1 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране(2 мл} и добавляют N îêñèñóêöèíèìèä (1 ммопь) а затем раствор N N -дициклогексип(„ карбодиимида (1 ммоль) в тетрагидрофуране (1 мл). Через 15 мин добавляют аминокомпонент (t ммоль) и смесь перемешивает при 20-25 С в течение 15-25 ч, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме, продукт повторно растворяют в подходящем растворителе, например в этилацетате, и промывают раствор последовательно водным раствором лимонной кислоты, водным раствором бикарбоната натрия и водой, сушат и упаривают в вакууме.
Реакция восстановления
9г14518
2-3 ч тонкослойной хроматографией.
Смесь концентрируют в вакуу 1е, остаточный водный раствор промывают этилацетатом. Смесь подкисляют добавлением лимонной кислоты и продукт либо экстрагируют подходящим растворителем, например этилацетатом, либо выделяют упариванием, если это осуществимо.
Экстракт промывают насыщенным рассолом, высушивают и упаривабт в вакууме, получают необходимое карбоксилсодержащее соединение.
32. Осуществляют, как и в 31, но применяют смесь воды, метанола и ацетона.
13. Осуществляют, как и в 31, но в качестве реакционной среды применяют водный метанол.
34. Гидролиз проводят с 1 экв.ч, гидроокиси натрия в. воде и продукт выделяют в виде его натриевой соли упариванием под вакуумом.
Д 5. Осуществляют, как и в Jl, но в качестве реакционной среды применяют диоксан.
Реакции ацилирования
Kl. К охлажденному льдом раствору соответствующего сложного моноэфира глицерина (1 ммоль) в хлороформе (1 мл), содержащем пиридин (3 ммоль), добавляют хлористый ацетил (3 ммоль) о и смесь перемешивают при 20-25 С в течение 18 ч. Растворитель отгоняют в вакууме и остаток вновь растворяют в этилацетате, раствор промывают последовательно водой, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия и водой. Высушенный экстракт упаривают в вакууме, остаток растирают с небольшим количеством метанола и фильтруют.
Сложный моноэфир глицерина, необходимый для такого ацилирования, получают следующим образом.
Сложный эфир, блокированный изопропилиденом (50 ммоль), в 2-метоксиэтаноле (300 мл) нагревают на паровой бане в течение б ч с борной кислотой (500 ммоль). Растворитепь отгоняют в вакууме и остаток растворяют в этилацетате.
После промывания водой раствор сушат и растворитель отгоняют в вакууме, получают сложный эфир в виде масла, которое подвергают дополнительной очистке хроматографией на колонке с применением кремнезема.
5 0
К2. Осуществляют, как и в Кl, но вместо хлористог э ацетила применяют хлористый пальмитоил.
К3. Блокированный бензилиденом сложный моноэфир глицерина (1 ммоль) и боную кислоту (4 ммоль) в триметилборате (5 мл) нагревают на паровой бане в течение 20 мин. Триметилборат отгоняют, остаток нагревают допол| ительно 20 мин на паровой бане.
Полученный продукт снова растворяют в этилацетате (30 мл), промывают водой и извлекают в виде свободного моноэфира глицерина упариванием. 3атем проводят ацилирование с помощью хлористого ацетила, как и в Kl.
К4. Осуществляют, как и в Кl, но для окончательного ацилирования применяют хлористый гексаноил.
Реакции этерификации
L1. .Безводную блокированную аминокислоту (10 ммоль) растворяют в сухом пиридине (10 мл) при 0 C и добавляют бензолсульфохлорид (1О ммоль).
Смесь перемешивают при 0 С в течение 15 мин,затем добавляют подходящий спиот (10 ммоль). Смесь перемешивают при 4 С в течение 18 ч, затем пиридин отгоняют в вакууме. Gcтаток растворяют в этилацетате (150 мл) и раствор промывают последовательно водой, 1 н.раствором соляной кислоты, водой, 2 н.раствором бикарбоната натрия и водой. Сушат и отгоняют. Получают неочищенный продукт.
L2. К перемешиваемому раствору соответствующим образом блокированной аминокислоты (5 ммоль) в пиридине (5 мл) при ООС добавляют фенол (10 ммоль) и N,iV -дициклогексилкарбодиимид (10 ммоль) и всю смесь о перемешивают при 4 С в течение 18 ч.
После фи. ьтрования смеси и упаривания пиридина в вакууме остаток растворяют в этилацетате (100 мл) и промывают последовательно водой, водным 2 H.ðàñòeîðîì бикарбоната натрия и водой. !
Экстракт сушат и упаривают, получают неочищенный сложный эфир.
L3. Подходящим образом замещенную аминокислоту (10 ммоль) растворяют в ацетонитриле при 0 С и добавляют необходимое количество спирта (10 мл) вместе с пиридином (20 ммоль) и
Х,N -дициклогексилкарбодиимидом (11 моль). Смесь перемешивают при
8 16 обьема, и продукт осаждают добавлением воды.
Другие реакции
Р1. 729 г I.1 ммоль) Вос-Tyr(Buè)-D-Ala-Gly-PIC-Leu-СЕ (исходное соединение 161), 0,55 мл (7 ммоль) чистого сухого пиридина и 0,$ мл (6,7 ммоль) свежеотогнанного уксусного ангидрида перемешивают при 2022 С в течение 10 мин.
Полученный раствор нагревают при
90-92 С в течение 6 ч, затем охлаждают и обрабатывают водой (15 мл).
Каменеподобное вещество отделяют, освобождают от верхнего слоя жидкости декантацией, промывают водой (5 х 15 мл) и растворяют в этилацетате (50 мл).
Раствор промывают последовательно 10 вес.об.4 водного раствора лимонной кислоты (4 к 10 мл), водой (1 5 мл), 10 вес.об.3 водного раствора бикарбоната калия (3 10 мл) и водой (3 10 мл), сушат (безводным сульфатом магния) и упаривают.
Спектр Я11Р полученного твердого остатка (530 мг) показывает, что он представляет собой смесь Ь,D,L,L
Ь,D,L,D-форм структурной форм. лы
СНуСЯИв
he -1% — СН вЂ” СОСИ
ОД1, Q)Q, 0,47 О(В ос -" ТУ (В ) -n >la - Д у -Р
15 90451
4 С в течение 18 ч, а затем фильтруtoT и растворитель отгоняют в вакууме.
Остаток обрабатывают этилацетатом и промывают последовательно водным раствором лимонной кислоты, водным раствором бикарбоната калия.
Экстракт сушат, упаривают в вакууме, получают неочищенный сложный эфир.
Ь4. Осуществляют, как и в L3, 16 но в качестве реакционной среды вместо ацетонитрила применяют ацетон.
Реакция с аммиаком
М1. Определенный сложный метиловый эфир пептида растворяют в минимальном количестве диметилформамида и приводят в контакт с избытком концентрированного раствора аммиака в
О этаноле в течение 3 дн. при 20-25 C.
Продукт выделяют осаждением водой.
Реакция с гидраэином
Сложный метиловый эфир пептида (l0 ммоль) растворяют в диметилформамиде (25 мл) и добавляют водный у
603-ный раствор гидрата гидразина (50 ммоль) . Смесь перемешивают при
20-25 С в течение 18 ч, концентрируют в вакууме примерно до половины
РРО,n,, 1 O,М, Р Р ф . К раствору соединения формулы М - 2У "(В Ф)-Д2, выделенного из
55,2 г (100имоль) его дициклогексиламиновой соли в сухом тетрагидрофура. не (300 мл) добавляют 50 мл (800 ммоль) йодистого метила, 8,6 г 4в гидрида натрия (300 ммоль) и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 18 ч на бане при 75 C.
Избыток гидрида натрия разлагают добавлением зтилацетата к охлажденной суспенэии, а затеи воды, получают почти прозрачный раствор, который концентрируют в вакууме.
Полученный водный раствор разбавляют водой (150 мл) и промывают дваж- Зв ды. Доводят значение рН водного раствора до 3 добавлением лимонной кислоты и продукт экстрагируют этилацетатом (400 мл, 2 200 мл). Экстракт промывают последовательно водой ss (100 мл), 10 вес.об.4 водного раствора тиосульфата натрия (100 мл), а затем вновь водой до нейтральной реакции промывных вод. Экстракт сушат над сульфатом магния, упаривают, получают масло, которое суспендируют в теплом петролейном эфире (200 мл, т.кип, 60-80 С), затем растворяют в этилацетате, из охлажденного до о
4 С раствора выпадает в осадок продукт формулы Z-Ме-(Bu )-ОН, т.пл.
96-99 С.
R1. К 5,33 г (17 ммоль) раствора соединения Phe Azley-MI> НС1 и
2,45 мл (17 ммоль) триэтиламина в
50 мл хлороформа добавляют 3,87 r (17 ммоль) раствора соединения формуае ZNHNH-СО-С1. Смесь выдерживают при температуре окружающей среды в течение 16 ч, а затем добавляют
400 мл зтилацетата. Раствор промывают последовательно водой, 20 вес.об.i водного раствора лимонной кислоты, высушивают над сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток чистят хроматографией на колонке с применением кремнезема, хлороформа, 2 об.4
904518
17 метанола в хлороформе и систем Р и
Q в качестве элюентов. Получают соединение формулы Z-Azgly-Phe Azley- Rg, т.пл. 116-120 С (с разл.) ..
$1. 17,5 г (30 ммоль) раствора, Z-Tyr(Bzl)-OCp и 4,38 r (30 ммоль)
Вос-M leNHg в 50 мл диметилформамида выдерживают в течение 18 ч при температуре окружающей среды. После разбавления 500 мл этилацетата раствор промывают последовательно водой, 20 вес.об.ь водного раствора лимонной кислоты и водой. Упаривание высушенного экстракта в вакууме приводит к получению твердого вещества, которое обрабатывает непосредственно раствором хлористого водорода (100 ммоль) в этилацетате в течение
2 ч при температуре окружающей среды. Растворитель отгоняет в вакууме, получают соединение формулы
Z-Туг(Вк1) -МЬНМе, 11С1, т.пл . 223224ОС, QD 0,82, Еф 0,64, RgQ 0,63.
9,4 г (20 ммоль) приведенного хлоргидрата растворяют в 200 мл хлороформа и добавляют 2,8 мл (20 ммоль) триэтиламина, а затеи 2,8 мл (20 ммоль) метилового эфира изоцианатоуксусной кислоты. Смесь перемешивают в течение 18 ч при температуре окружающей среды, растворитель упаривают в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате, промывают последовательно водой, 20 вес.об. водного раствора лимонной кислоты, насыщенным раствором бикарбоната натрия и водой. Высушенный экстракт упаривают в вакууме, получают соединения формулы Z-Tyr(Bzl) Aza1a-Сну-ОЙ-, которое после перекристаллизации из смеси метанола с эфиром имеет т.пл, 107-108 С.
Примечания (сноски) к табл.4-19.
1. Очищают осаждением
2. Т.пл. 160-161 С (c разл.)
3. Перекристаллизовывают из пето ролейного эфира (т . кип . 60-80 С )
4. Перекристаллизовывают из смеси изопропанола с эфиром (т.пл.181 183 C)
5. Перекристаллизовызают из изопропанола (т.пл. 193- 194 С)
6. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением хлороформа и 2 об.3 метанола в хлороформе
7. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением хлороформа
8. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением хлороформа и системы P
18
9. Перекристаллизация из этилацетата (т.пл. 128-130 C)
10. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением 25 об.З этилацетата в циклогексане
11. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением системы G
t2. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром
1в (т.кип. 60-80 С, т.пл. 96-99 C)
13. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 202-203 С)
14. Перекристаллизация из этилацетата (т.пл. 122-123 С)
15. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением систем P
H Q
16. Перекристаллизация из этилрв ацетата (т.о> 177- 179 С)
17. Ьерекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.пл. 60-80 С), т.пл. 122-123 С)
18. Перекристаллизация из смеси д этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 108,5-110 С)
19. Перекристаллизация из метанола (т.пл. 219-220 С)
20. Перекристаллизация из смеси
ЗО этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 121-122 С)
21. Иерекристаллизация из смеси толуола с бензолом
22. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 133-135 C)
23. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением системы P
24. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением 3 об.3
40 метанола в хлороформе
25. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением системы Q
26. Пзрекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 122-124ОС
27. Перекристаллизация из смеси этилацетата с етролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 115-118 С
28. Перекристаллизация из водного метанола, т.пл. 162-163 С
29. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 130-132 С
30. Иерекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром ,(т.кип. 60-80 С), т.пл. 156-157 С
31. Лиофильная сушка в присутствии НС1
904518
37. Колоночная хроматограф я на кремнеземе с применением системы К
38. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 172-174 С
39. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип, 60-80 С),т.пл. 140-141 С
40. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением смеси этилацетата с метанолом
41. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром
В С D Р I I К (}
R,.10
II ep
Полилептид
50 41 87 16
30 69 77
61 30 83
60 22 74
6I 48
57 90
66 52 85
60 59 50 84 17
71 79 7У 66 53
16 И-. Туз -Ь- Яег-01у-Phe- Ьеи- О И0
СНОАе
&z0ke
17 g- ÒÓÓ-D- Зе1 - С1У=УЬе-Lau- OCH0
СЕОСОС10Нз1
СН2ОООС10Н01
18 и-Тут-И-ау-Р1 е-Leu"àÍ(ÑÊ,àAc), 32. Лиофильная сушка
33., Колоночная хроматография на кремнеземе с применением систем Р, Я и К
34. Перекристаллизация из смеси этилацетата с циклогексаном, т.пл.
163" 164е С
35. Перекристаллизация из смеси метанола с эфиром, т.пл. 130-131 С 10
36. Гидролиз сложного эфира в про цессе операции (исходное соединение 137) 1 Н-МеТут-D Ala-Яу Phe-Leu-01 Ь
2 Н-Тут-D-А1а Azgly-РЬе Azleu-MI2
3 Н Tyr-D Ala-C1y-Pla-Leu-0(СИ ) 14I 22 Я
4 II-Тут-D-А1е-Gly-Phe-Leu-0(A 12)2J4II е
5 Н- Tyr-D Ala-Gly-Phe-Leu-M i<
6 Н-Tyr-0-А1а-Gly-Р1ю-Х1е-Ф1е
7 il-Tyt"D Ala-Сlу- 1ю(бН) -Lcu<1
8 Н-Tyr-0 Ala-С1у-Р1к(бН) -Leu-ОИе
I I Tyr-0-AsP-Gly-Ple-Lcu-Caie
10 Н-Tyr-Аза1а-С1у Phe-LeuWI 1 Н-Тут-0-Ееа-С1у-Phe-Ladle
12 1 -Тут-D-Яет-Сlу Azphe-Leu-64e
1} Н-Тут-0-Зет-С1у-Pie-Leu-0(й0)вСН
14 Н-Tyr-D-Se ly-Р11е-Leu&(GQ) ОАс
15 Н-Тут-D-Бет-С1у Phe-Leu<(G ) ОСП- Н 2 --МИ
19 Н Тут-0-хт-Gly-Р) е Leu (0+ +<
32 55 55 20 60
67 67 50 60 50 46 95
67 71 65 67 50 8У (59 68 62 59 49 44 89
65 64 54 56 54 40 81
67 73 73 55 60 94
67 71 65 58 60 . 44 90
61 68 54 54 51 33 85
904518
22 на на 10
ФФФМвеммв Овьедо Примечания
Н7 Соль IK1 очищают хроматографией на кремнеземе с применением 25 об.2 смеси метанола и хлороформа и растворителя К
Н5 Соль IK1 осаждают добавлением смеси метанола с эфиром
Н9 Соль с 2НОАс получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет."бутанолом й» 72
Н9 Соль с 2НОАс получают а виде высушенного лиофильной сушкой порошка или си воды с трет.-бутанолом в присутствии IIC1
4». 74
Н9 Очищают хроматографией на кремнеземе с применением 25 об. смеси метанола н хлороформа, в присутствии растворителя К
122
134
Н9 Соль с НОАС
Н9 Получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка иэ воды илн смеси с трет.-бутанолом
Н2 Выделяют упариванием после фильтрования через диатомовую землю
137
Н2 Получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет.-бутанолом, т.пл. I43 C
127
Н5 Соль IIC1 выделяют упариванием после фильтрации через диатомовую землю
12в
Н9 Соль IIC1 получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет.-бутанолом в присутствии IK1
Н5 Соль !К:1 осаждают добавлением эфира; т,пл. 157ОС
138
Нll Соль трифторуксусной кислоты (ТФК) осаждают добавлением смеси зтилацетата с эфиром, т.пл. 103 С (раэл.) I 13
Hl l Соль ТФК выделяют упариванием после фильтрования через диатомовую земле;
l l4
Hl l Сола ТФК выделяют упариванием после Фильтрования через днатомовую землю, т пл. 87еС (раэл.) Н11 Соль ТФК выделяют упариванием после фильтрования через диатомовую землю, т.пл. 9В С (разл.) H l1 Соль ТФК выделяют упариванием после фильтрования через диатомовую землю
Hll Соль ТФК выделяют упариванием после Фильтрования через диатомовую землю, т.пл. 146-143 аьС
117
Нl l Соль IICl получают в виде высушенного лиофильнои сушкой порошка иэ воды или смвСи воды с трет.-бутанолом
21 (т.кип. 60-80 C), т.пл. 162-165 С (с разл.)
42. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 C), т.пл. 111-113 С s
4). Колоночная хроматография кремнеземе с применением 1 об.3 метанола в хлороформе
44. Колоночная хроматография кремнеземе с применением систем и К
45. Т.пл. 121-122 С
46. Перекристаллизация из этилацетата, т.пл. ".48-250 С
47. Очистка на Сефадексе Ш 20 в диметилформамиде
48 ° Перекристаллизация из смеси э1илацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 152-155 С
49. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 164-168 С
50. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением 5 об.4 метанола в этилацетате, Таблица ! 904518
Пример й, 1И
Полипевтид
76
59 47 80
62 63 62
52
49
29 li-Туг В-А1а-Сlу-Р3в Leu-йг-01
51 20
51 78 55 53 10 48
25 57
7 8 6 32
65 76 40 49 12 13 88
40 69 32 60 65
63 60 30
37 й»01ю 01уОЙ Н» Ly Tyr Р-А1а-03у ygа-Здм-@(а 36 60 27
Ъ, 38 Б-Рго-Яа-С1в-Туг-0-А1а-Сlу-Р!м-Leu le 50
68,9
41 Н- Oly- С1у"С1у И-3та- Tyr -21 Ala-Щ-РЬ0 "«® 0000 28 66 25 42
20 И-Туг-D-Se&fy-Phe-Leu
21 Н D Thr-С1у-Р1ю-Leu<а, 22 Н-Тут-D-ТьрС1у-РЬа-Lcu-(Ме
23 Н-Туг-В Ala -Gly-Pae-Ио-0 а
24 1 -Ala-Туз D-А1а-Яу-Pie-Leu-6а
25 Н-Asp-Т)т-0-Аlа-Яу-РЬе-beau-ЭЬ
26 H Lys 10Ъг 1 8аг С1У Phe Leu-Ct e
27 я-2 За "т 0Э-ЛЬ-Ñly-Пе«ВЬ-жя 3=
28 Lys(le)-QrD-А1а ЯУ Рло 1 а -©
30 . Н-С1у-С1у-Туг-ПАЬ-Gly-Phe-Еа-ЭЬ
31 и-АВР И - Lp-ЧФР «9-А а- Qlу-Ъ| -1,ам-aNe
32 И-LY0 8-1фВ-Ф е -В-Ale- С1у-РМ-Ьеи-Oge
33 Ь.Агу»Рго-Lys Tyr-D-А1а-С1у-Phe-Leu-9le
34 H-ЯУС1у-Gly Tyr&Ala-Яу Phe-Leu-ИЬ
35 Н-Сlу-Gly-С1у"Туг-0 Ser-С1у-Р1в(бЩ-Leu-0 Ь
36 И-Leu-Lou"Leu-ТугЬ-А1а-С1у-Phe Leu-8 le
39 H-Азр-Яу-С1у"С1у-.Туг-0 Ala-Giy-Ьв-В а.4Ив
40 И-Lys-Gly-Gló-С1у-Tyr-0-А1а-Иу-Phe-ЬИИе
4Ф ll-Arg-1 го-Lys-Pro-Gln-С1и-Туг-D-Л1а-Г1у-Pl@-Le&21e
63 59 85 23
66 28 8
29 66
26 51 22
73 76 77 68 57 55
90 66 19 34
32 72 4
9 14518
26
"родолщвние табл. 1
«Ъ Ф
Исходное соединение
Способ
Примечания
12В г
Н9 Соль HGi получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси Воды. с трет.-бутанолом в присутствии 11С1
130
Н5 Соль НС1 выделяют упариванием после фмльтрования через диатоиовую землю
131
135
Н9 Выделяют упариванием после фильтрования через дматомовую землю
178
Н1 Соль ИС1 очищают ма сефадексе С-15 в 5 об. водной уксусной кислоты
Н9 Соль НС1 получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет."бутанолом в присутствии 1Е1
200
209
Соль с 2НС1 очищают хроматографией на кремнеземе с применением 25 об. смеси метанола и