Способ индикации васillus cereus
Патент 905278
Авторы
Способ индикации васillus cereus
Иллюстрации
Реферат
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советски к
Соцнапистнчеснна
Республик (ii >905278 (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 13.05 80 (2! ) 2936994/28 — 13 с присоединением заявки рй (28) Приоритет (53)N. Кл .
С 12 и 1/00/!
//С 12 N 1/00, С 12 R 1 085
3Ьаударстааииый камитет
СССР ао делам изобретений и аткрнтий
Опубликовано 15 02 82 Бюллетень М 6
Дата опубликования описания 15.02.82 (53) УДК 576.8. .093.1 (088.8) A А. Кузнецов, С. И. Кудрявцев, И. М. Суворковй и Т, М. Москвина (72) Авторы изобретения!
Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ BACILLUS CEAEUS
Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам определения вида микроорганизма по реакции иммунофлуоресценции.
Известен способ индикации Bacillus cereus в суспензии, содержащей смешанную микрофлору, путем добавления к суспензии микроорганизмов люминесцирующих антител, отмывания от несвязавшихся ыггител с последующим возбуждением суспензии светом и определением интенсивности свечения (1 J.
Однако при снятии спектра, близкое расположение пика светорассеяния, при некотором превышении концентрации примесных микроорганизмов в пробе. над специфичньп4и, приводит к наложению пика светорассеяния на пнк люминесценции, что не позволяет достоверно определить наличие искомых микроорганизмов в присутствии примеси, и снижает чувствительность способа.
Цель изобретения — повышение точности
I способа.
Эта цель достигается тем, что согласно способу индикации Bacillus cereus в суспензии, содержащей смешанную микрофлору, путем добавления к суспенэии микроорганиз, мов люминесцнрующих антител, отмывания от несвязавшихся антител с последующим возбуждением суспензия светом и определением интенсивности свечения, суспензию возбуждают при 365 нм, дополнительно регистрируют интенсивность светорассеяния суспензии в начале пика люминесценции и наличие микроорганизма определяют по отношению
1О интенсивности люминесценции в максимуме пика к. интенсивности светорассеяния.
Пример. Берут суспенэию микроорганизмов культуры Bacillus cereus в концентрации 2 10 кл/мл в количестве 4 мл.
3з
В реактор с клетками прибавляют 1 мл раствора антител (меченых флуоресцеиниэотиоцианатом) для получения концентрации антител по белку равной 1 — 2 мг на 1 мл
20 суспензия. Сусиензию инкубнруют в течение
10 — 15 мин прн комнатной температуре, периодически встряхивая. Затем суспенэию центрифутируют 15 мии при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок окра90527 шенных микроорганизмов два раза отмывают от несвязавшихся антител 5 мл физиологического раствора, цептрифугируя, как описано выше. Отмытые кл тки суспендируют (перемешив1ют) в новой порции физиологического раствора и переносят в флуориметрическую кювету. Суспензшо возбуждакг светом в оолее коротковолновой области, а именно в области 365 нм. Снятие спектра эмиссии проводят на сканирующем приборе а1Р3 — 5000, позволяющем записать спектр в области от 460 до 600 нм на самописце.
3; лем измеряют в относительных единицах интенсивность люминесценции в области
530 нм (максимум пика) и интенсивность светорассеяиия в области начала пика люминесценции 480 нм. Определяют отношение интенсивности шоминесценции к интенсивности светорассеяния.
Результаты индикации Bacillus cereus приведепм ь т абл. 1.
Интенсивность излучения суспензии Baci l lus"
cereus в концентрации 1 10 клеток в 1 мл в исследуемых областях 0,70 и 0,58, а отношение 0,83, Интенсивность излучения суспензии Bacillus cereus в .концентрации 2.10, обработанной люминесцирующими аитителамй, 0,01 и 0,42, а отношение 42. Таким образом, неокрашенная суспензия в концентрации
1 10 показывает интенсивность в области
530 нм 0,58, Torpa
Примесные микроорганизмы, в качестве
46 которых использована культура Escherihia
coli в концентрации 1 109 кл/мл, обработанные люмннесцирующими антителами и двухкратно огмьпые физиологическим раствором, показывают интенсивности 0,14 и 0,14, а отношение 1,0. Отношение окрашенных искомых микроорганизмов в 40 раэ нревышает отношение обработанных примесных микроорганизмов, тогда как интенсивность искомых, в области 530 нм превышает интенсивность примесных в этой области только в 3 раза.
Добавление примесньи микроорганизмов в концентрации, в 50 и 500 раз превышаю8 cf щей искомые (1 109 и 1 l01о) пает огно шение 5,4 и 3,2.
Таким образом, отношение смеси превышает отношение обработанных и отмытых примесных клеток приблизительно в 5 и 3 раза и свидетельствует. о наличии в пробе искомых микроорганизмов.
При более низких концентрациях антител: можно достоверно определить наличие искомых микроорганизмов в пробе.
В табл. 2 представлены результаты индикации Bacillus cereus для малых концентраций суспензии.
Искомые микроорганизмы в концентрации
2.10 кл/мл смешивают с примесными в концентрациях 5.10, 1 10" и 5 10 кл/мл, а также, берут отдельно искомые2 10 кл/мл и примесные 5 10 кл/мл. Люминесцируюшче антитела берут в концентрации 1,4 мг/мл.
Суспензии с 25, 50 и 250 кратным превышением примеси над искомыми микроорганизмами дают приблизительно одинаковые интенсивности в области 530 нм, однако некоторое изменение в начале пика люминесценции приводит к изменению отношения, которое снижается с увеличением примеси и составляет:
7, 6,6 и 5,0 при 24,0 в лютой культуре.
Эти же пробы, но без обработки люминесцирующими антителами, дают интенсивность в области начала пика люминесценции:
0,2, 0,2 и 0,72, а отношения меньше 1,0.
Эти данные показывают, что у всех необра.
60танных люминесцирунзщн1ии ан ят ла гч .."-, спензий интенсивность светорассеяния выше, чем у обработанных. Из этого следует, что отношение исследуемых интенсивностей в присутствии примеси снижается,. однако примесь не маскирует присутствие искомых микро. организмов в пробе, и эта закономерность сохраняется при низких концентрациях искомого микроорганизма в пробе.
Предлагаемый способ позволяет точно определить вид микрооргыппма в объеме пробы на фоне примеси в промышленных условиях и в санитарно-защитной зоне предприятий микробиологической промышленности, где незначительно превышение примесных над искомьтьяя микроорганизмами, Способ с успехом может быть использован для стандартизации и оценки качества люминесцирующих антител, изготавливаемых в производстве, 905278
Таблица 1
Концентрация люмянесцн руалцих аи тнтел, мг/мл
Интенсив ность ра
СЕЯННОГ света и бм, относзп ель онце
Baclllu
Название мнкроор
Нет
0,70 0,58 0,33
0,0! 0,42 42,0
Bacillus cereus
Нет
10т
Bacillus cereus
Весд!ОЯ сете08
Escherihia coli
0,07 6,38 5,4
2 108
1 10»
Bacillus cereus
Escherihia coli
2,10т
l ..)pie
0,18 0,58 3,2
0,14 0,14 1,6, 0,27 0,25 6,93
Нет
1 .10
Escherihie coH
Escherihia cali
1 .)0le
Т а б л н ц а 2
Интенсивность рассеязпФЛ свете, отноипельнме единицы
Концентрация Концентрадня Концентрация
6ас61оз саге- Eschar ihia люмннесцяus, кл/мл col i кл/мл рующих аннскомые прямесные тнтел, мг/мл
Название микроорганизма
B8cHIUs сесeUs
Escherihia col i
2 108
5 Н)т
0,63
l,4
Bacillus cereus
Escherihia col i
1 .108
0,20
2 108
0,03
1,4
Bacillus cereus
Escherihia coti
2.108
5,0
0,24
S -108
0,05
l,4
24,0
0,24
0,01
2.108
l,4
Bacl I IUs сеГецз
2,5
0,2
5 108
0,68
),4
Escherihia coli
Baci l lUs cereus
Eschar ihia cali
0,5
5 -1О
О,l
0,2
2 108
Bacillus cereus
Escherihia coIi
0,45
0,09
1 108
0,20
2 .10
Вас дlus сетера
Escharihia coH
0,44
2 10
0,32
5 -108
0,72
0,38
0,20
2 108
Bacillus cereus
Escherihia coIi
0,60
5 108
Нет итращы
erlhla кл/мл симе ность люЬИНМСЦЕИцни, отно свтельиме единицы
Отношение лтеминесттенции K caeIo. рассеяин36
Составитель С. Малютина
Техред Э.Вереш Корректор Г Шомак
Редактор Н. Киштулинец
Тираж 504 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д, 4/5
Заказ 291/37
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
7 905278 8
Формула изобретения сивность светорассеяния суспензии в начале пика люминесценции и наличие микроорганиэСпособ индикации Bacillus cereus в суспен ма определяют по отношению интенсивности зии, содержащей смешанную микрофлору, люминесценции в максимуме пика и интенвутем добавЛения к суспензии микроорганиз- 5 сивности светорассеяния. мов люминесцирующих антител, отмывания Источники информации, от несвязавшихся антител C оследуялцим принятые во внимание при экспертизе возбуждением суспензии светом и определе- 1. Рубан С. 3. Использование прямой флуо нием интенсивности свечения, о т л и ч а- риметрдй для количественной оценки в люю щ и Й с я тем, что, с целью повышения 10 минесцентосерологическом методе индикации точности способа, суспензию возбуждают при микроорганизмов. Автореф. дис. на соиск.
365 нм, дополнительно регистрируют интен- учен. степени канд. биол, наук. М., 1974.