Индоксиловый эфир n-ацетиллейцина как реагент гистохимического анализа

Индоксиловый эфир n-ацетиллейцина как реагент гистохимического анализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических респубики

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<,906991 (61) Дояолннтеяьное к авт. свнд-ву (22) Заявлено 16.11.79 (21) 2855453/23-04 с присоединением заявки М— (23 ) П рнорн тет (5))М. Кл.

С 07 0 209/12

С 07 С 101/04

РнудврствааИ квквтвт

СИР ао аелви «эвврвтвквй н втквыткй

Опубликовано 23.02.82. Бюллетень М 7

Дата опубликования описания 23.02.82 (53) УЩ 547.233.

07 (088.8) P. Б. Айсина, И. П. Андрианова, И. В. Березин, Е. В. Лукашева, H. Ф. Казинская и В. В. Рыжова

)1

Cj

Г

Московский ордена Ленина, ордена Трудового Крфтвого Знаьгейтв-" и ордена Октябрьской Революции Государственнйй уннвереагте, им. М. В. Ломоносова .„ Д (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) ИНДОКСИЛОВЫЙ ЭФИР И вЂ” АЦЕТИЛЛЕЙЦИНА КАК РЕАГЕНТ

ГИСТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

Изобретение относится к получению нового производного нндоксила, а именно индоксилового эфира N-ацетиллейцина, который может найти применение в гистохимическом анализе.

Индоксиловые эфиры уксусной и масляной кислот являются субстратами протеолитических ферментов и широко используются для гистохимических исследований. Принцип . их действия основан на получении окрашенного соединения — индиго, которое образуется при самопроизвольном окислении кислородом воздуха нидоксила, выделяющегося при расщеплении эфира ферментом (1) и (2).

Однако индоксилацетат и индоксилбутират не расщепляются трипсином, а в случае химотрипсина и ряда других протеаз расщепляются со скоростью, недостаточной для обес20 печения высокой чувствительности анализа.

Известен способ получения индоксилацетата взаимодействием индоксииа с ангидридом кислоты (3).

Цель изобретения — получение нового эфира индоксила, обладающего повышенной расщепляемостью llo отношению к протеоли-; тическим ферментам.

Для этого к щелочному раствору индоксила в диоксане по каплям прн охлаждении реакционной смеси льдом добавляют ангидрид Н-ацетиллейцина. Ангидрид М-ацетиллейцина получают известнымв приемами, например ацилнрованием лейцина избытком уксусного ангидрида. В связи с тем, что свободный иидоксил — нестойкое соединение, легко окисляющиеся кислородом воздуха, реакцию проводят в токе аргона.

Реакционную смесь нейтрализуют, экстрагируют хлороформом, хлороформ удаляют перегонкой, а остаток очищают хроматографически на силикагеле. Выход индоксилового эфира й-ацетиллейцина 30%.

Реакция получения индоксилзвого эфира

N-ацетиллейцина может быть .представлена следующей схемой:

906991

ОН

Субстрат а-химотрипсин трипснн

2103

Не гидролизуется

2,5» 10"

17,7 " - сн-Сн,— сн — co 1О

ЮСОСЦ6 (ОЙ J, 3

o-co-сн-сн-сй

t т С 3

И

Иидоксиловый эфир Й-ацетиллеицина изучен в качестве субстрата ферментов а-химотрнпсина и трипсина. Для сравнения его с другими субстратами исследуют кинетику гидролиэа трех эфиров индоксила — индоксил ацетата, индоксилбутират, индоксилацетиллейцина. Замена остатка уксусной или масляной кислоты в ацильной части субстрата на остатой ацетнлнрованного лейцина приводит к увеличению константы скорости реакции гид-, © ролиза индоксилового эфира в случае а.химотрипсина в 8 ° 10а раэ, Предлагаемое соединение расщепляется также с большой скоростью иод действием трипсина.

Пример i. Получение ангидрида

N-ацетиллейцииа.

К 13,1 r й-лейцина прибавляют 25 мл 4н.

ИаОН и реакционную смесь охлаждают ледяной водой. Затем по каплям одновременно добавляют 189 мл уксусного ангидрида и

50 мл 4 н. Na0H. После того, как все реагенты добавлены, реакционную смесь перемешивают 15 мин и подкисляют концентрированной HCI до рН 1. Выпавший осадок

Й-ацетиллейцнна отфильтровывают, промыва- 35 ют 10 мл ледяной воды и сушат.

К 9 r полученного И-ацетиллейцина прибавляют 50 мл (СНэСОО) и перемешивают на магнитной мешалке до тех пор, пока не растворится весь N-ацетиллейцин. Уксусный,фр анпщрид отгоняют, остаток выдерживают в вакууме масляного насоса в течение 2 ч.

Получают 8,5 r вязкого масла, содержащего ангидрид N-ацетиялейцина.

Индоксиловый эфир уксусной кислоты

Индоксиловый эфир H-мас ляной кислоты

Индоксиловый эфир N-ацетиллецина

Пример 2. Получение ипдоксильно го эфира Й-ацетиллейцина.

К раствору 1,8 r индоксила в 57 мл раствора йаОН в токе аргона прибавляют

15 мл диоксана. Реакционную смесь охлаждают ледяной водой и в течение 30 мнн прибавляют по каплям раствор 8,5 r масла, полученного в 30 мл диоксана. После прибавления всего ангидрида реакционную смесь оставляют на 1 ч при охлаждении ледяной водой. Затем прибавляют 2,8 мл СНэОН в

15 мл диоксана и 2,8 мл СНЗСООН в 15 мл диоксана. Реакционную смесь упаривают досуха, к остатку добавляют 75 мл Н 0 и

25 мл хлороформа. Хлороформенные вытяжки объединяют, промывают 10 мл воды, сушат и упаривают. Остаток наносят на колонку с силикагелем н делят в системе бенэол— диоксан 4:1. Вьщеляют 1,1 г (30%) чистого ащоксилового эфира N-ацетнллейцина с

r. пл. 141ОС.

Элементный анализ:

Вычислено, %: С 66,65; 66,45, Н 6,99.

Найдено, %: С 66,38 — 6645; Н 6,93 — 6,85.

Пример 3. Исследование свойств иццоксилово о эфира а-ацетиллейцина.

При определении кинетических параметров реакции гидролиза индоксиловых субстратов а-химотрипсином до индоксила эксперимент проводят прн рН 8,0 и 25.С 0,2 M NaCI, 0,02 M CaCI и 10 об,% ацетона.

Концентрация трипсина и а-химотрипсина в ячейке рН-стата 10" — 6 10" М; над реакционным раствором продувают азот, Концентрации в ячейке иидоксилацетата 2,5

0,3 мМ; индоксилбутирата 1,0 — 0,05 мм; индоксилацетиллейцина 2,5 — 0,6 мМ. Найденные кинетические параметры приведены в таблице.

Таким образом, иидоксиловый эфир N àöå-. тиллейцина значительно превосходит прнменяилциеся в гистохимическом анализе субстраты-красители по скорости гидролиза ферментами.

Формула изобретения

Индокснловый зфнр N-ацетиллейднна формулы сн, 0C0GH-ÑÍ -СН !Н ®"з

Составитель Л. Иоффе

Техред Ж,Ка релевиц Корректор М. ПожЬ

Редактор Г. Кацалап

Заказ 510/30 Тираж 448 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 как реагент гистохнмнческого анализа.

906991 6

Источники информаиии, примятые во внимание при экспертизе

1. Ьурстон Н.С. Гистохимия ферментовл

М., "Мир", 1965.

s 2. Липли P. Д. Техника и практика гистохнмии и гнстопатологии. М., "Мир", 1967.

3. Acylderivate е!ег !щ!оху!айне und dee

Indoxyls», Ber. (1902), 35, 1701,